高效液相色譜法測(cè)定3 種蛹蟲草中蟲草素及比較分析

李 琴，廖紅華，張 馳,2,*

（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000）

高效液相色譜法測(cè)定3 種蛹蟲草中蟲草素及比較分析

李 琴1，廖紅華1，張 馳1,2,*

（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000）

對(duì)3 種蛹蟲草中蟲草素含量進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定并比較，以查看不同地區(qū)來源的蛹蟲草中蟲草素含量的區(qū)別，為選育高含量蟲草素蛹蟲草菌種及改變其培養(yǎng)條件指明方向。首先采用正交試驗(yàn)研究蟲草素的提取條件，獲得最適提取工藝，即料液比1∶80、提取時(shí)間5 h、提取溫度70 ℃，在此條件下蟲草素的得率達(dá)0.604%（以湖北地區(qū)的蛹蟲草作為原料）。然后在此條件下分別對(duì)湖北地區(qū)（A）、云南地區(qū)（B）和本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)（C）的蛹蟲草中提取蟲草素并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：樣品C的蟲草素含量遠(yuǎn)高于A（6.041 mg/g）和B（7.606 mg/g），為26.071 mg/g。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的蛹蟲草中蟲草素含量有一定區(qū)別，這可能與培養(yǎng)蛹蟲草所用的菌種和培養(yǎng)條件差異有關(guān)。本研究篩選出來的菌種以及獲得的培養(yǎng)方法，對(duì)后續(xù)研究補(bǔ)硒栽培對(duì)蛹蟲草中的活性成分蟲草素含量的影響提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

蛹蟲草；高效液相色譜法；蟲草素

蟲草素即3’-脫氧腺苷，分子式為C10H13N5O3，分子質(zhì)量為249 u，堿性，針狀或片狀結(jié)晶[1]。蟲草素是第一個(gè)從真菌中分離出的核苷類抗菌素，蛹蟲草是300多種蟲草中唯一能大量產(chǎn)生蟲草素的蟲草[2]。蟲草素作為蛹蟲草的次生代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗病毒、干擾人體RNA及DNA合成，顯著抑制多種腫瘤生長(zhǎng)的作用[3-7]。蟲草素還表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、擴(kuò)張支氣管、顯著增強(qiáng)腎上腺素等藥理作用功能[8-9]。另外，Bellomcik等[10]研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素還具有殺蟲作用。有研究[11-13]采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法梯度洗脫測(cè)定蛹蟲草中蟲草素含量取得良好的效果，本研究首先對(duì)等度洗脫與梯度洗脫進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的條件下，等度洗脫對(duì)蟲草素測(cè)定的保留時(shí)間不能很好的控制，其塔板數(shù)也低于梯度洗脫，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用梯度洗脫，測(cè)定3 種蛹蟲草中蟲草素的含量并比較其差異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 種蛹蟲草子實(shí)體分別來自于湖北地區(qū)（A）、云南地區(qū)（B）、本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)（C）。將3 種樣品分別進(jìn)行烘干（40 ℃）、粉碎（40 目）并密封保存。

甲醇（色譜純） 日本Dikma公司；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)MUST-11072701） 上海雅吉生物科技有限公司；

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DZonEX-P860型高效液相色譜儀 戴安中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蟲草素的提取

以料液比、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，采用正交試驗(yàn)對(duì)蟲草素提取條件進(jìn)行研究（以湖北地區(qū)的蛹蟲草樣品作為原料）[14]。

1.3.1.1 單因素試驗(yàn)

料液比對(duì)蟲草素提取的影響：稱取樣品0.2 g，置于帶塞試管中，選擇1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100，10 個(gè)料液比水平，超聲波處理30 min，60 ℃水浴提取2 h，提取液定容至25 mL。

時(shí)間對(duì)蟲草素提取的影響：稱取樣品0.2 g，置于帶塞試管中，料液比1∶50，選擇2、3、4、5、6、7、8 h，7 個(gè)時(shí)間水平，超聲波處理30 min，60 ℃水浴提取，提取液定容至25 mL。

溫度對(duì)蟲草素提取的影響：稱取樣品0.2 g，置于帶塞試管中，料液比1∶50，選擇40、50、60、70、80、90 ℃，6 個(gè)溫度水平，超聲波處理30 min，水浴提取5 h，提取液定容至25 mL。

1.3.1.2 提取蟲草素的正交試驗(yàn)

以料液比1∶80、1∶90、1∶100三個(gè)水平，提取時(shí)間3、4、5 h三個(gè)水平，提取溫度40、50、60 ℃三個(gè)水平選擇L9（34）正交表進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）流動(dòng)相：水-甲醇，柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min，波長(zhǎng)260 nm。梯度洗脫如表1所示。

表1 蟲草素測(cè)定梯度洗脫順序表Table 1 Gradient elution for HPLC analysis of cordycepin

1.3.3 3 種蛹蟲草中蟲草素的含量測(cè)定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取10 mg蟲草素標(biāo)品，溶于10 mL容量瓶中，定容至刻度，即為1 mg/mL蟲草素溶液。再分別取0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mL上述溶液于5 個(gè)10 mL容量瓶中，定容至刻度，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜壓濾后，按1.3.2節(jié)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為X軸，峰面積為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：Y=1.486 7X+1.034，R2=0.999 1，結(jié)果表明：蟲草素質(zhì)量濃度在25～125 μg/mL范圍內(nèi)均與峰面積線性關(guān)系良好。

1.3.3.2 樣品中蟲草素含量測(cè)定

采用1.3.1節(jié)中獲得的蟲草素最佳提取條件對(duì)3 種蛹蟲草的蟲草素分別進(jìn)行提取，并按照1.3.2節(jié)中的色譜條件對(duì)其蟲草素得率進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草中蟲草素提取條件的優(yōu)化

2.1.1 料液比對(duì)蟲草素得率的影響

如圖1所示，隨著提取劑比例的增加，蟲草素得率隨之增大，除1∶20和1∶30料液比水平之間差異不顯著外，其余各個(gè)水平間有顯著差異（P＜0.05）。

圖1 料液比對(duì)蟲草素得率的影響Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of cordycepin

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)蟲草素得率的影響

如圖2所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲草素得率逐漸升高，提取時(shí)間為2、3、4、5 h，4 個(gè)時(shí)間水平時(shí)，各水平之間蟲草素得率有顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)提取時(shí)間增加至5 h后，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，得率無顯著差異。

圖2 提取時(shí)間對(duì)蟲草素得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of cordycepin

2.1.3 提取溫度對(duì)蟲草素得率的影響

如圖3所示，當(dāng)提取溫度逐漸從40 ℃升至70 ℃，蟲草素得率隨溫度的升高而逐漸增加。溫度在40 ℃和50 ℃兩個(gè)水平之間得率沒有顯著差異，而與60、70 ℃兩個(gè)水平相比，各水平間具有顯著差異（P＜0.05）。溫度繼續(xù)升高至80、90 ℃，得率反而減小，80 ℃和90 ℃兩水平之間差異不顯著。

圖3 提取溫度對(duì)蟲草素得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of cordycepin

2.1.4 蟲草素提取條件研究的正交試驗(yàn)

根據(jù)表2極差分析結(jié)果可知，該正交試驗(yàn)研究的3 個(gè)因素：料液比（A）、提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）的R值均大于空列，說明這3 個(gè)因素對(duì)蟲草素得率具有顯著影響。其中因素C的R值最大，其次分別是B和A，表明對(duì)蟲草素得率影響最大的因素是C，次之是B、A。為了分析A、B、C 三個(gè)因素各水平對(duì)蟲草素得率的影響，對(duì)該正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析。由表3可知，提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）的P值均小于0.05，而料液比（A）的P值大于0.05，說明因素B和C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，因素A影響不顯著，根據(jù)F值大小得出的三因素影響的主次性，與極差分析結(jié)果一致。提取蟲草素的最合適工藝為A1B3C3，即料液比1∶80、提取時(shí)間5 h、提取溫度70 ℃，在此條件下蟲草素得率達(dá)0.604%。最佳工藝條件驗(yàn)證表明，5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值為0.615%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值為0.83%，方法重復(fù)性好，所獲得的最適工藝條件穩(wěn)定可靠。

取25 μg/mL標(biāo)品，連續(xù)進(jìn)樣5 次，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其峰面積RSD值為0.85%，色譜峰保留時(shí)間波動(dòng)在0.01～0.07 min，精密度良好。

穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如表4所示，在不同的時(shí)間進(jìn)樣同一份樣品，峰面積RSD值為0.20%，穩(wěn)定性良好?；厥章蕼y(cè)定結(jié)果如表5所示，蟲草素回收率在99.72%～100.45%之間，RSD值為0.29%，回收率實(shí)驗(yàn)良好，表明本實(shí)驗(yàn)中采用的色譜方法準(zhǔn)確度較高。

表2 蟲草素提取9L（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of orthogonal array design L9(34) for cordycepin extraction

表3 蟲草素提取條件研究正交試驗(yàn)方差分析表（L9（34）Table 3 Analysis of variance for orthogonal array design L9(34)

表4 穩(wěn)定性測(cè)定Table 4 Stability of the HPLC method

表5 回收率測(cè)定（n=5）Table 5 Spiked recoveries of cordycepin in real samples (n=5)

2.2 3 種蛹蟲草中蟲草素含量的比較

采用HPLC測(cè)定蛹蟲草樣品（A：湖北地區(qū)的蛹蟲草；B：云南地區(qū)的蛹蟲草；C：本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)）中的蟲草素含量，A和B樣品中蟲草素含量分別為6.041、7.606 mg/g，遠(yuǎn)低于C樣品中的含量26.071 mg/g，各樣品HPLC色譜圖如圖4所示，蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的色譜條件下保留時(shí)間為10.80 min，塔板數(shù)19 182，而等度洗脫（V（水）∶V（甲醇）=85∶15）[15]保留時(shí)間14.82 min，塔板數(shù)8 796，因此本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，峰形良好。測(cè)定樣品時(shí)，蟲草素與其他成分分離良好，對(duì)其進(jìn)行回收率測(cè)定，平均回收率為99.99%，RSD為0.29%。

圖4 蛹蟲草蟲草素HPLC色譜圖Fig.4 HPLC profiles of cordycepinstandard and Cordyceps militaris samples

3 結(jié)論與討論

本研究通過比較不同地區(qū)來源的蛹蟲草在蟲草素含量上的區(qū)別，為選育高含量蟲草素蛹蟲草菌種及改變其培養(yǎng)條件明確方向。首先通過對(duì)蛹蟲草中蟲草素的提取條件進(jìn)行研究，獲得最佳提取工藝：即料液比1∶80、提取時(shí)間5 h、提取溫度70 ℃，在此條件下蟲草素的得率達(dá)0.604%，在此條件下測(cè)定3 種蛹蟲草樣品（A：湖北地區(qū)的蛹蟲草；B：云南地區(qū)的蛹蟲草；C：本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)）的蟲草素含量，發(fā)現(xiàn)各樣品中蟲草素含量有一定差異，且樣品C的蟲草素含量明顯高于A和B（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)采用的蛹蟲草樣品均為人工培養(yǎng)，蟲草素含量差異的出現(xiàn)可能與菌種和培養(yǎng)環(huán)境的差別有關(guān)[16-18]，檢測(cè)來自湖北地區(qū)的蛹蟲草硒含量為49.25 μg/g，蟲草素含量為6.041 mg/g，本實(shí)驗(yàn)室通過不同硒濃度梯度培養(yǎng)的蛹蟲草硒含量在35.48～51.66 μg/g時(shí)，蟲草素在25.930～26.931 mg/g，分析其原因發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的蛹蟲草與購自湖北地區(qū)的成品所采用的菌種分離于不同的母種，培養(yǎng)蛹蟲草采用的培養(yǎng)條件也有差異。首先，人工培養(yǎng)蛹蟲草技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)并趨于成熟，而人工培養(yǎng)的蛹蟲草菌種最初也是從野生蛹蟲草菌中分離純化出來的，然后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得的。野生蛹蟲草生長(zhǎng)的環(huán)境要求沒有冬蟲夏草苛刻，其分布的地區(qū)較廣，各地區(qū)自然環(huán)境具有一定差異，所以分離出來的蛹蟲草菌具有相應(yīng)的一些差別，如次生代謝產(chǎn)物蟲草素的分泌。當(dāng)然，分離出來的菌種，經(jīng)過人工誘變[19-20]，也可能會(huì)出現(xiàn)一些特別的蛹蟲草菌種，如蟲草素分泌豐富的蛹蟲草菌種。其次，人工培養(yǎng)的蛹蟲草各地區(qū)采用的培養(yǎng)基可能不同?，F(xiàn)階段，大多數(shù)采用大米作為培養(yǎng)基的主體，但其中的C、N含量，激素種類，激素比例等因素使得培養(yǎng)基的組成有很大差別，也可能導(dǎo)致蛹蟲草中蟲草素含量的不一致。最后，蛹蟲草的人工培養(yǎng)工廠化已實(shí)現(xiàn)，對(duì)于蛹蟲草質(zhì)量品質(zhì)的把握，蟲草素作為檢驗(yàn)其品質(zhì)的指標(biāo)之一，其含量高低必定會(huì)影響蛹蟲草產(chǎn)品的市場(chǎng)銷售額，因此，各生產(chǎn)基地有必要對(duì)所培養(yǎng)的蛹蟲草進(jìn)行抽樣測(cè)定，并定期更新菌種，以獲得高品質(zhì)蛹蟲草。對(duì)于補(bǔ)硒對(duì)蛹蟲草中蟲草素含量的影響，賁松彬等[21]研究發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)富硒培養(yǎng)條件下，蛹蟲草中蟲草素含量是非富硒菌絲體的5.8 倍，達(dá)2.22 mg/g。本實(shí)驗(yàn)室也作了初步研究，同一菌種采用不同硒濃度培養(yǎng)，比較硒和蟲草素含量，發(fā)現(xiàn)在菌種所能耐受的硒濃度范圍內(nèi)，隨著補(bǔ)硒濃度的增加，硒和蟲草素含量都逐步增加。在一定硒濃度范圍內(nèi)，硒的增加有利于蛹蟲草的生長(zhǎng)代謝，蛹蟲草的次生代謝產(chǎn)物蟲草素分泌增多，在本實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上，將做更深一步的研究驗(yàn)證。

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Comparative HPLC Determination of Cordycepin in Cordyceps militaris from Different Locations

LI Qin1, LIAO Hong-hua1, ZHANG Chi1,2,*
(1. College of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 2. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

A comparative study was carried out to determine cordycepin as one of the active ingredients in the fruit bodies of Cordyceps militaris from different locations in China by HPLC. Using orthogonal array design, the optimal extraction conditions were obtained as follows: 1:80, 5 h and 70 ℃ for solid-to-solvent ratio, extraction time and temperature, respectively. Under the optimized conditions, the fruit bodies of Cordyceps militaris from Hubei province gave rise to a yield of cordycepin of 0.604%. HPLC analysis showed that the fruit bodies of Cordyceps militaris cultured in our laboratory contained 26.071 mg/g cordycepin, much higher than in those from Hubei and yunnan provinces (6.041 and 7.606 mg/g, respectively). This difference was likely related to the strain and culture conditions. The strain and culture method proposed in this study have the potential to provide the technical foundation for future studies on the inf l uence of selenium-supplemented culture medium on cordycepin content in Cordyceps militaris.

Cordyceps militaris; high performance liquid chromatography (HPLC); cordycepin

TS201.2

A

1002-6630（2014）14-0118-05

10.7506/spkx1002-6630-201414023

2014-03-23

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（61263030/F030304）；湖北省科技廳重點(diǎn)基金項(xiàng)目（2011CDA011）；生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（PKLHB1113）

李琴（1986—），女，碩士研究生，主要從事植物硒的生理生化研究。E-mail：1342260627@qq.com

*通信作者：張馳（1965—），男，教授，碩士，主要從事植物生物化學(xué)及硒資源研究。E-mail：zhtzu@163.com