高效液相色譜法測(cè)定紫蘇中5 種有機(jī)酸和黃酮的含量

秦紅英，周光明*，彭貴龍，李俊平

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

高效液相色譜法測(cè)定紫蘇中5 種有機(jī)酸和黃酮的含量

秦紅英，周光明*，彭貴龍，李俊平

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

目的：建立以甲醇溶液為萃取劑，結(jié)合超聲輔助萃取，利用高效液相色譜法同時(shí)分離測(cè)定紫蘇中的咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素5 種有效成分的方法。方法：采用Phenomenex C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%冰醋酸溶液，采用梯度洗脫程序；流速1 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm；柱溫35 ℃。結(jié)果：該方法對(duì)咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素分別在0.001 22～61.00（r=0.999 99）、0.001 06～53.00（r=0.999 99）、0.001 28～64.00（r=0.999 91）、0.001 20～60.00（r=0.999 94）、0.001 12～56.00 μg/mL（r=0.999 95）范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999 91，檢出限（RSN=3）依次是：0.101 9、0.392 6、0.355 9、0.286 2、0.202 5 ng/mL；樣品回收率為95.79%～101.41%。結(jié)論：本法操作簡(jiǎn)單快速、定量準(zhǔn)確、靈敏度高、成本低、且對(duì)環(huán)境友好，為紫蘇中咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的分離檢測(cè)提供了一個(gè)有效的方法。

黃酮；有機(jī)酸；超聲輔助萃取；高效液相色譜法；紫蘇

紫蘇（Perilla frutescens）為唇形科紫蘇屬（Perilla frutescens (L.) Britton）植物紫蘇全草，又名白蘇、赤蘇等，氣清香，味微辛，具有止咳平喘、解表散寒、行氣和胃、理氣寬中、止痛安胎等功效，主要用于痰壅氣逆、咳嗽嘔惡、風(fēng)寒感冒、妊娠嘔吐、胃脘疼痛、胸膈痞悶、魚(yú)蟹中毒等病癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，紫蘇是一種極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的保健資源[2]，主要含有黃酮類(lèi)化合物、迷迭香酸、咖啡酸、阿魏酸等多種生物活性成分[3-5]，具有良好的抗氧化[6-7]、抗癌[8]、抗炎[9]、抗菌[10]、抗過(guò)敏、保肝[11-12]、降血脂[13]、調(diào)節(jié)血糖[14]等藥理作用。目前雖已有紫蘇中相關(guān)活性成分的測(cè)定研究報(bào)道，如Chen等[15]報(bào)道了高效液相色譜法分析紫蘇中的三萜類(lèi)化合物的方法，馬堯等[16]報(bào)道了紫外分光光度法測(cè)定紫蘇中總黃酮含量的方法，黃亮輝等[17]報(bào)道了高速逆流色譜分離純化紫蘇葉中迷迭香酸的方法；但同時(shí)分離測(cè)定紫蘇中有機(jī)酸和黃酮的方法尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用超聲輔助萃取及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分離同時(shí)測(cè)定了紫蘇中咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素5 種有效成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇原藥材（經(jīng)西南大學(xué)周光明教授鑒定） 當(dāng)?shù)厮幏?；咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素?duì)照品（純度均≥99%） 上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（純度≥99%） 中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所；甲醇、乙醇、冰醋酸（均為分析純） 重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠；磷酸（分析純） 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT液相色譜輸液泵、SPD-20A紫外檢測(cè)器、CTO-10AS柱溫箱、LC-Solution色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 日本島津公司；KH-3200B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；TGL-16G高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SZ-2自動(dòng)雙重純化水蒸餾器 上海瀘西分析儀器廠有限公司；LIDA pH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%冰醋酸溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～5 min，45%～53% B；5～10 min，53%～55% B；10～15 min，55%～60% B；15～20 min，60%～45% B。流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm；柱溫35 ℃。

1.3.2 對(duì)照品溶液的配制

對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱(chēng)取咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素對(duì)照品適量，甲醇溶解，分別配制成610 μg/mL咖啡酸、530 μg/mL阿魏酸、640 μg/mL迷迭香酸、600 μg/mL木犀草素、560 μg/mL芹菜素的溶液對(duì)照品儲(chǔ)備液，避光保存，待用。

混合對(duì)照品溶液：分別準(zhǔn)確吸取3 種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相配制成一系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，置于冰箱（4 ℃）內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 供試品溶液的制備

將紫蘇于60 ℃干燥至恒質(zhì)量后粉碎，過(guò)60 目篩（0.5～1.2 mm），干燥條件下保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g紫蘇粉末，加入10 mL甲醇，浸泡4 h，超聲萃取30 min，過(guò)濾取濾液，離心10 min（3 500 r/min），取上清液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

為選擇最佳的檢測(cè)條件，本實(shí)驗(yàn)比較了CH3OHH2O、CH3OH-CH3COOH、CH3CN-CH3COOH，CH3CNH3PO4體系對(duì)5 種目標(biāo)分析物的分離效果。當(dāng)流動(dòng)相為CH3OH-H2O體系時(shí)，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸3 種組分峰不能完全分離，且木犀草素、芹菜素2 種組分峰拖尾嚴(yán)重。當(dāng)流動(dòng)相為CH3OH-CH3COOH時(shí)，在合適的梯度條件下，5 種目標(biāo)物出峰時(shí)間適宜，分離度良好，且峰形對(duì)稱(chēng)性好。在以CH3CN-CH3COOH、CH3CN-H3PO4為流動(dòng)相時(shí)，不斷改變梯度條件，5 種組分峰峰形和分離度均未有較大改善，且CH3CN毒性遠(yuǎn)大于甲醇，而H3PO4易損壞色譜柱，故選擇CH3OHCH3COOH體系為流動(dòng)相。在色譜柱允許的pH值范圍內(nèi)，考察了醋酸比例對(duì)峰形的影響，當(dāng)醋酸比例為0.1%時(shí)，峰形最佳，分離度均大于2.0（圖1），故最終選擇CH3OH-0.1% CH3COOH體系為流動(dòng)相。

圖1 混合對(duì)照品溶液HPLC圖Fig.1 Chromatogram of standard solution mixture

2.2 提取溶劑的選擇

為了選擇合適的提取劑提高萃取率，本實(shí)驗(yàn)分別采用離子液體[BMIm]PF6、[OMIm]PF6、[HMIm]PF6以及甲醇、乙醇溶液為提取劑，在相同萃取條件下比較對(duì)目標(biāo)分析物的提取效果。結(jié)果表明，以乙醇和離子液體為萃取劑時(shí)，5 種目標(biāo)分析物的提取率下降，且離子液體會(huì)影響HPLC分析時(shí)的分離度；當(dāng)以甲醇溶液作為提取劑時(shí)，咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的提取率均明顯提高。故本實(shí)驗(yàn)最終采用甲醇溶液作為萃取劑。此外，本實(shí)驗(yàn)還考察了不同浸泡時(shí)間對(duì)提取效果的影響，通過(guò)浸泡不同時(shí)間后提取分析比較，表明浸泡4 h提取效果最佳。

2.3 固液比的選擇

為了得到最佳的提取效果，本實(shí)驗(yàn)考察不同的固液比對(duì)提取率的影響。固液比分別為1∶20、1∶30、1∶50、1∶80、1∶100（g/mL）時(shí)，當(dāng)固液比為1∶80（g/mL）時(shí)5 種目標(biāo)分析物的提取率顯著提高，因此，本實(shí)驗(yàn)以1∶80（g/mL）為最佳固液比（圖2）。

圖2 紫蘇供試品溶液HPLC圖Fig.2 Chromatogram of Perilla frutescens sample

2.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察

分別精密量取1.3.2節(jié)混合對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋至不同質(zhì)量濃度。從低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度，依次進(jìn)樣，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3 次，每次20 μL，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行HPLC分析，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1。

表1 線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 1 Regression equations, linear ranges and LODs (n=3)

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的質(zhì)量濃度分別為12.2、10.6、12.8、12.0、11.2 μg/mL的對(duì)照品混合液20 μL，按照1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行HPLC分析。重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定各個(gè)對(duì)照品的峰面積，結(jié)果咖啡酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.05%，阿魏酸峰面積RSD為1.32%，迷迭香酸峰面積RSD為1.84%，木犀草素峰面積RSD為1.72%，芹菜素峰面積RSD為1.33%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取1.3.3節(jié)供試品溶液20 μL，在避光條件下，于0、4、8、12、16、20、24、48 h分別進(jìn)樣，測(cè)定咖啡酸的峰面積RSD為0.97%，阿魏酸的峰面積RSD為1.72%，迷迭香酸的峰面積RSD為1.68%，木犀草素的峰面積RSD為1.79%，芹菜素的峰面積RSD為1.29%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批紫蘇樣品6 份，按照1.3.3節(jié)方法制備，1.3.1節(jié)色譜條件測(cè)定。結(jié)果咖啡酸峰面積RSD為1.34%，阿魏酸峰面積RSD為2.25%，迷迭香酸峰面積RSD為1.18%，木犀草素峰面積RSD為1.96%，芹菜素峰面積RSD為2.48%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的同一批紫蘇樣品0.1 g 9 份，分成3 組，每組按照低、中、高3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確加入對(duì)照品混合液，按1.3.3節(jié)方法制備，1.3.1節(jié)色譜條件測(cè)定?？Х人帷⑽核?、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的回收率測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recoveries of five compounds in spiked samples

2.9 樣品含量的測(cè)定

取同一批紫蘇樣品3 份，按照1.3.3節(jié)方法制備，1.3.1節(jié)色譜條件測(cè)定，樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。記錄紫蘇樣品色譜圖，見(jiàn)圖2。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=3）Table 3 Results of determination of samples (n=3）

3 結(jié) 論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用分析純的甲醇作為流動(dòng)相，與使用色譜純的甲醇作流動(dòng)相的文獻(xiàn)報(bào)道相比，目標(biāo)分析物峰形良好，且無(wú)雜質(zhì)干擾峰，大大降低了實(shí)驗(yàn)研究成本。

3.2 為了選擇合適的流動(dòng)相體系，本實(shí)驗(yàn)選擇了CH3OH-H2O、CH3OH-CH3COOH、CH3CN-CH3COOH、CH3CN-H3PO44 種流動(dòng)相體系對(duì)5 種目標(biāo)分析物的分離效果進(jìn)行比較。在不斷調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例的前提下，以CH3OH-H2O為流動(dòng)相時(shí)，咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸3 種組分峰不能完全分離，且木犀草素、芹菜素2 種組分峰拖尾嚴(yán)重；而其他3 種流動(dòng)相體系在合適的梯度條件下，5 種目標(biāo)分析物分析時(shí)間短，且分離度均達(dá)到2.0以上，但乙腈比甲醇的毒性和成本更高，而磷酸對(duì)色譜柱的損害較大，故最終選擇CH3OH-CH3COOH作流動(dòng)相。黃亮輝等[18]在對(duì)不同采收期的紫蘇葉和白蘇葉中迷迭香酸的含量研究中，采用了甲醇-0.1%磷酸水溶液作流動(dòng)相，迷迭香酸出峰時(shí)間在25 min左右，而本實(shí)驗(yàn)中5 種目標(biāo)分析物的出峰時(shí)間均在16 min以?xún)?nèi)。

3.3 由于目標(biāo)分析物易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑及溶解性能良好的離子液體，本實(shí)驗(yàn)分別采用離子液體[BMIm]PF6、[OMIm]PF6、[HMIm]PF6以及甲醇、乙醇溶液為提取劑，在相同萃取條件下比較對(duì)目標(biāo)分析物的提取效果，與以甲醇作萃取劑相比，以離子液體為萃取劑時(shí)，5 種目標(biāo)分析物的提取率明顯降低，且離子液體黏度太大不利于色譜分析；以乙醇作萃取劑，雖然能夠降低毒性，但5 種目標(biāo)分析物的總提取率顯著低于甲醇，故最終采用甲醇作萃取劑。與榮維燕等[19]用乙醇超聲輔助提取紫蘇葉黃酮的研究相比，本實(shí)驗(yàn)中總黃酮提取率更高，并有效提取了紫蘇中的有機(jī)酸。

3.4 相關(guān)紫蘇中有機(jī)酸和黃酮的文獻(xiàn)報(bào)道不一，如張蕾蕾等[20]采用微波法提取測(cè)定紫蘇中的黃酮，亦有采用HPLC測(cè)定紫蘇中有機(jī)酸的含量[21]，但鮮有關(guān)于紫蘇中咖啡酸、阿魏酸、芹菜素的報(bào)道，且尚未有對(duì)于紫蘇中黃酮和有機(jī)酸的同時(shí)分離測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)建立了以甲醇溶液為萃取劑，結(jié)合超聲輔助萃取，利用HPLC同時(shí)分離測(cè)定紫蘇中的咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素5 種有效成分的方法。在優(yōu)化的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，5 種目標(biāo)成分萃取率高，分離完全。該方法操作簡(jiǎn)便、檢出限低、定量準(zhǔn)確，為紫蘇的有效成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供了科學(xué)依據(jù)。

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Determination of Five Organic Acids and Flavonoids in Perilla frutescens by High Performance Liquid Chromatography

QIN Hong-ying, ZHOU Guang-ming*, PENG Gui-long, LI Jun-ping
(Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis, Ministry of Education, College of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Objective: A simple high performance liquid chromatography (HPLC) method has been developed for the simultaneous quantif i cation of caffeic acid, ferulic acid, rosmarinic acid, luteolin and apigenin from Perilla frutescens using methanol as extractant with ultrasonic-assisted extraction. Methods: The fi ve compounds were isolated by using a Phenomenex C18column by gradient elution, and the mobile phase was methanol-0.1% acetic acid solution with a fl ow rate of 1.0 mL/min. The UV detection wavelength was performed at 320 nm. Results: The linear ranges for caffeic acid, ferulic acid, rosmarinic acid, luteolin and apigenin were determined to be 0.001 22-61.00, 0.001 06-53.00, 0.001 28-64.00, 0.001 20-60.00 and 0.001 12-56.00 μg/mL, respectively, and the correlation coeff i cients were 0.999 99, 0.999 99, 0.999 91, 0.999 94 and 0.999 95, respectively. The limits of detection (LOD) were 0.101 9, 0.392 6, 0.355 9, 0.286 2 and 0.202 5 ng/mL, respectively. The average recoveries of these compounds in spiked real samples were in the range of 95.79%-101.41%. Conclusion: The proposed method is simple, precise, specif i c, sensitive and accurate. It provides a new and scientif i c means for routine quality control of Perilla frutescens.

organic acids; fl avonoids; ultrasonic-assisted extraction; high performance liquid chromatography; Perilla frutescens

O652.62

A

1002-6630（2014）14-0102-04

10.7506/spkx1002-6630-201414020

2013-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21277110）

秦紅英（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯V分析。E-mail：qinruobing@sina.cn

*通信作者：周光明（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯V及其聯(lián)用技術(shù)。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn