海藻酸鈉和乳清蛋白作為益生菌包埋壁材的比較

鄒 強(qiáng)，梁華忠，龔春雪，唐仁勇,*

（1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川高福記生物科技有限公司，四川 成都 600732）

海藻酸鈉和乳清蛋白作為益生菌包埋壁材的比較

鄒 強(qiáng)1，梁華忠2，龔春雪1，唐仁勇1,*

（1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川高福記生物科技有限公司，四川 成都 600732）

利用海藻酸鈉和乳清蛋白分別制備包埋有兩歧雙歧桿菌的微膠囊，測(cè)定了不同微膠囊的粒徑、包埋效率、緩沖能力和外觀形態(tài)，同時(shí)還考察了不同微膠囊對(duì)兩歧雙歧桿菌保護(hù)效果的影響。結(jié)果表明：乳清蛋白微膠囊的粒徑和包埋效率均要高于海藻酸鈉微膠囊，分別為202.5 μm，87.8%和118.3 μm，48.1%；雖然在高膽鹽環(huán)境中兩種微膠囊對(duì)兩歧雙歧桿菌的保護(hù)效果沒(méi)有顯著差別，但在低酸環(huán)境、模擬胃液和常溫貯藏期中，相比于海藻酸鈉微膠囊，乳清蛋白微膠囊將兩歧雙歧桿菌的存活量分別提高了大約5、2、0.5（lg（CFU/mL））。乳清蛋白微膠囊在pH值偏中性的環(huán)境中具有較高的緩沖能力；在外觀形態(tài)上，由高濃度乳清蛋白溶液制備而來(lái)的微膠囊具有較好的呈球性和致密度，這些可能是乳清蛋白微膠囊具有較高保護(hù)效果的原因。

海藻酸鈉；乳清蛋白；微膠囊；益生菌

包埋技術(shù)作為一種最為有效的保護(hù)策略已被廣泛用來(lái)提高益生菌在不利環(huán)境中的存活率[1-3]。毫無(wú)疑問(wèn)，包埋壁材的選擇對(duì)于益生菌的保護(hù)效果具有重要的作用。用于益生菌包埋最常采用的壁材是海藻酸鈉，但是，近幾年越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)：由于海藻酸鈉膠體的多孔特性使得它不能完全有效地限制胃液的滲透作用[4-5]，因此，海藻酸鈉對(duì)于益生菌在胃液中的保護(hù)作用非常有限。蛋白質(zhì)所形成的凝膠具有良好的pH值敏感性、可控的通透性和較高的凝膠強(qiáng)度，所以蛋白質(zhì)被廣泛用作各種生物活性成分的包埋壁材[6-7]。除此之外，通過(guò)酶、酸以及鈣離子的交聯(lián)作用，蛋白質(zhì)能夠在室溫下形成結(jié)構(gòu)致密的凝膠，并且該反應(yīng)條件溫和，這將有利于對(duì)熱易失活的生物活性成分進(jìn)行包埋，也是由于蛋白質(zhì)這些優(yōu)良的特性，使得蛋白質(zhì)成為了極具前景的益生菌包埋壁材，尤其是在人體消化道中對(duì)益生菌保護(hù)作用已被許多研究證實(shí)[8-9]。但蛋白質(zhì)是否能夠取代海藻酸鈉作為益生菌主要的包埋壁材至今還存有疑問(wèn)。

用于益生菌包埋的方法主要有擠壓和乳化，相對(duì)于擠壓方法，由乳化方法制備得到的益生菌微膠囊具有粒徑小，表面致密，且易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)[10-12]。因此本實(shí)驗(yàn)首先以海藻酸鈉和乳清蛋白為壁材通過(guò)乳化方法制備兩種不同壁材的微膠囊，考察了不同微膠囊對(duì)益生菌包埋效果的影響，并探討了包埋壁材對(duì)益生菌保護(hù)作用的機(jī)制，為益生菌包埋壁材的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

兩歧雙歧桿菌（Bif i dobacterium bif i dum）F-35 本實(shí)驗(yàn)室保藏；分離乳清蛋白（純度94.0%） 北京銀河經(jīng)貿(mào)有限公司。

海藻酸鈉 美國(guó)Sigma公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（酶活力1 000 U/g） 江蘇一鳴生物科技有限公司；胃蛋白酶（10 000 NFU/mg）、胰蛋白酶（來(lái)自于豬胰腺） 美國(guó)BBI公司；其他試劑均為分析純。

ULTRA-TURRAX T8均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；BT-9300H激光粒度分析儀 遼寧百特儀器有限公司；FreeZone?6L冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)及樣品準(zhǔn)備

將冷凍保藏的B. bifidum F-35在MRSC（過(guò)濾滅菌的半胱氨酸加入到滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中，半胱氨酸質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL）瓊脂培養(yǎng)基上畫(huà)線培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)48 h厭氧培養(yǎng)后，挑單菌落于20 mL MRSC液體培養(yǎng)基中，并在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h，然后按1.0%的接種量轉(zhuǎn)接到30 mL的MRSC液體培養(yǎng)基中在厭氧條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，12 h后，將處于對(duì)數(shù)期末期的菌懸液在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心10 min，去上清，菌泥用無(wú)菌的NaCl溶液（8.5 g/L）洗滌兩次后，重懸于2 mL的無(wú)菌水中得到濃縮菌液，此時(shí)濃縮菌液的菌密度大概在109CFU/mL。最后利用平板計(jì)數(shù)法對(duì)該濃縮菌液進(jìn)行精確計(jì)數(shù)。

1.2.2 微膠囊的制備

海藻酸鈉微膠囊（alginate microcapsules，AM）的制備參照Catarina等[13]的方法：首先將2 mL濃縮菌液與20 mL 2.0 g/100 mL的海藻酸鈉溶液混合，之后將CaCO3微晶均勻地分散到該混合溶液中，其中CaCO3的加入量是海藻酸鈉質(zhì)量的7.3%，然后再將此混合液乳化到100 mL含有體積分?jǐn)?shù)1.0% Span80大豆油中（300 r/min），15 min后，加入20 mL含有冰醋酸的大豆油，冰醋酸和CaCO3的物質(zhì)的量比值為3.5，持續(xù)攪拌，以促進(jìn)CaCO3微晶和冰醋酸的接觸反應(yīng)，30 min后，向該體系加入120 mL的醋酸鹽溶液（pH 5.5）并緩慢攪拌，待凝膠成型的微膠囊都沉降到醋酸鹽溶液底部后，吸去油相，過(guò)濾收集AM，洗滌2 次以去除剩余油相。最后讓過(guò)濾收集得到的微膠囊在4 ℃條件下存放于0.2 g/100 mL NaCl溶液中。

乳清蛋白微膠囊（whey protein microcapsules，WPM）的制備參照Heidebach等[14]的方法：將2 mL濃縮菌液與20 mL熱變性（80 ℃、0.5 h）的10 g/100 mL乳清蛋白溶液混合后，快速加入TGase（10 U/g）并漩渦振蕩使其分散均勻，將此混合液加入到250 mL錐形瓶中，該錐形瓶中盛有150 g預(yù)熱的（40℃）大豆油，然后使該體系在磁力攪拌器的作用下（900 r/min，40 ℃）反應(yīng)180 min，待液滴在酶的作用下轉(zhuǎn)化為凝膠顆粒后離心（500 r/min，1 min），收集微膠囊顆粒并用林格氏試劑清洗2 次，在700 r/min條件下離心5 min，重新收集膠體顆粒，貯存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 包埋B. bif i dum F-35的計(jì)數(shù)

包埋B. bif i dum F-35的計(jì)數(shù)方法主要參照Annan等[15]的方法：將0.5 g過(guò)濾得到的微膠囊加入到4.5 mL預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液中（37 ℃，0.1 mol/L NaH2PO4，pH 8.0），通過(guò)高速均質(zhì)機(jī)來(lái)破碎微膠囊（10 000 r/min，45 s），緩慢搖晃此破碎液30 min，使海藻酸鈉膠體完全液化并釋放包埋的兩歧雙歧桿菌F-35，取一定量的液體，經(jīng)稀釋后，涂布于MRSC瓊脂培養(yǎng)基上，然后讓平板在37 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。包埋效率用式（1）計(jì)算。

式中：N為包埋于微膠囊中的活細(xì)胞總數(shù)/CFU；N0為濃縮菌液中的總菌數(shù)/CFU。

1.2.4 微膠囊的形態(tài)觀察及其粒徑分析

取一小滴微膠囊分散液置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)。將冷凍干燥后的微膠囊置于玻璃皿內(nèi)，用1.0%的四氧化鋨氣體固定，用雙面膠將其黏在樣品臺(tái)上，離子濺射后用掃描電鏡觀察微膠囊表面結(jié)構(gòu)。微膠囊的粒徑分布是通過(guò)激光粒度分析儀來(lái)測(cè)定，平均粒徑表示為體積平均粒徑D（4，3），表示的是微膠囊粒徑對(duì)體積的加權(quán)平均值。

1.2.5 B.bif i dum F-35在模擬胃液和高膽鹽溶液中的存活實(shí)驗(yàn)

模擬胃液的配制：用濃鹽酸溶液將0.2 g/100 mL NaCl溶液的pH值調(diào)節(jié)至2.0，然后加入一定量的胃蛋白酶并使其終質(zhì)量濃度為0.3 g/L，最后用0.22 μm的膜進(jìn)行過(guò)濾滅菌；高膽鹽溶液的配制：將膽鹽均勻地分散于磷酸鹽緩沖液中，它的終質(zhì)量濃度為4.5 g/L，然后用0.1 mol/L NaOH溶液將此混合液的pH值調(diào)至7.4并滅菌。

將0.5 mL濃縮菌液或者0.5 g微膠囊加入到4.5 mL在37 ℃條件下預(yù)熱的模擬胃液或高膽鹽溶液中，用漩渦振蕩器充分振蕩10 s，然后在37 ℃、100 r/min條件下溫育2 h。在5、30、60、120 min時(shí)，用高速均質(zhì)器對(duì)樣品溶液進(jìn)行破碎，并按照上述方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6 緩沖能力的測(cè)定

海藻酸鈉溶液和蛋白質(zhì)溶液在不同pH值條件下緩沖能力的測(cè)定主要參照Salaun等[16]的方法：首先配制30 mL 2.0 g/100 mL的海藻酸鈉溶液和乳清蛋白溶液（質(zhì)量濃度2.0 g/100 mL和4.0 g/100 mL），然后用濃度為0.5 mol/L的鹽酸溶液按照0.33 mL/min的速度將上述溶液的pH值從初始值滴定至2.5左右，每滴定一定量的鹽酸溶液后，就記錄當(dāng)時(shí)樣品溶液的pH值。在一定pH值下，下降單位pH值所需要的鹽酸量即為該pH值條件下樣品溶液的緩沖能力，其計(jì)算見(jiàn)式（2）。

1.2.7 B.bif i dum F-35在常溫條件下的貯藏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將冷凍干燥后的微膠囊放置于無(wú)菌的西林瓶中，然后在抽真空的情況下進(jìn)行熱封口，把封口好的西林瓶放置于常溫條件下貯藏1 個(gè)月，每隔15 d從西林瓶中取樣并按對(duì)B.bif i dum F-35進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin7.5作圖，采用One-way ANOVA法統(tǒng)計(jì)分析其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同包埋壁材對(duì)微膠囊粒徑和包埋效率的影響

表1 兩種微膠囊的粒徑和包埋效率Table 1 Particle sizes and microencapsulation yields of two different microcapssuulleess

粒徑和包埋效率是評(píng)價(jià)微膠囊的重要指標(biāo)，不同壁材對(duì)微膠囊的粒徑和包埋效率均有顯著的影響。由表1可知，海藻酸鈉制備得到的微膠囊粒徑為118.3 μm，且該微膠囊對(duì)B. bif i dum F-35的包埋效率為48.1%，而通過(guò)蛋白質(zhì)制備得到的微膠囊粒徑則在此基礎(chǔ)上增加了84.2 μm，并且對(duì)B. bif i dum F-35的包埋效率高達(dá)87.8%。

2.2 不同包埋壁材對(duì)B. bif i dum F-35保護(hù)效果的影響

2.2.1 不同微膠囊在模擬胃液中對(duì)B.bif i dum F-35保護(hù)效果的影響

相比于未經(jīng)包埋的B. bif i dum F-35，包埋后的B.bif i dum F-35在模擬胃液中的存活率都有不同程度的增加，尤其是在不加胃蛋白的低酸環(huán)境中，WPM將B.bif i dum F-35的存活量提高了大約7（lg（CFU/mL））。通過(guò)D值（在一定的處理?xiàng)l件下，殺滅90%細(xì)菌所需要的時(shí)間）發(fā)現(xiàn)：在低酸環(huán)境中，WPM（D值=124.3 min）對(duì)B.bif i dum F-35的保護(hù)作用要好于AM（D值=20.4 min），但是胃蛋白酶的加入明顯減弱了WPM對(duì)B.bifidum F-35的保護(hù)效果，其D值只是略高于包埋于AM中細(xì)胞的D值（24.6 min）。

表 2 2 B. bif i dum um F-35在模擬胃液（pH 2.0，37 ℃，2 h）中的存活情況Table 2 Survival rate ofB. bif i dum um F-35 after incubation in simulated gastric juice (pH 2.0, 37 ℃, 2 h)

2.2.2 不同微膠囊在高膽鹽環(huán)境中對(duì)B.bif i dum F-35保護(hù)效果的影響

表 3 3 B.bif i dum dum F-35在高膽鹽溶液（2.0%, 37 ℃，2 h）中的存活情況Table 3 Survival rate ofB. bif i dum um F-35 after incubation at high concentration of bile salt solution (2.0%, 37 ℃, 2 h)

由表3可知，用高膽鹽環(huán)境（2.0 g/100 mL）處理2 h后，未經(jīng)包埋處理的B. bifidum F-35死亡了大約3（lg（CFU/mL）），而經(jīng)過(guò)包埋處理的B. bifidum F-35卻只死亡了大約1（lg（CFU/mL））。AM和WPM的在這高膽鹽環(huán)境中對(duì)B. bifidum F-35的保護(hù)效果上并沒(méi)有顯著差異，兩者的D值處于同一顯著水平上。

2.3 乳清蛋白和海藻酸鈉在緩沖能力上的差異

鄒強(qiáng)等[17]考察了微膠囊不同特性（緩沖能力、凝膠強(qiáng)度、乳化能力、滲透性）對(duì)益生菌在低酸環(huán)境中保護(hù)作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)壁材的緩沖能力對(duì)保護(hù)效果影響最大。因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了海藻酸鈉和乳清蛋白在不同pH值范圍內(nèi)的緩沖能力，結(jié)果如圖1所示。在pH＞4.5時(shí)，海藻酸鈉溶液的緩沖能力要低于相同質(zhì)量濃度下乳清蛋白溶液的緩沖能力，尤其是在接近中性的pH值環(huán)境中，這種差距更為明顯，說(shuō)明了在此pH值范圍內(nèi)，乳清蛋白具有較高的緩沖能力，并且這種緩沖能力隨著乳清蛋白濃度的增加而提高。當(dāng)pH＜4.5時(shí)，海藻酸鈉緩沖能力急增，并且超過(guò)了乳清蛋白溶液的緩沖能力。有研究表明，牛乳中的蛋白質(zhì)具有一定的pH值緩沖能力，將牛乳加入到模擬胃液中能夠提高環(huán)境的pH值從而增加益生菌在胃酸中的存活率[18-19]。

圖1 包埋壁材在不同pH值條件下的緩沖能力Fig.1 Buffering capacities of the suspensions of different coating materials under different pH conditions

2.4 不同包埋壁材對(duì)微膠囊外觀形態(tài)的影響

圖2 冷凍干燥后微膠囊的掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.2 Scanning electron micrographs of freeze-dried microcapsules

由圖2可知，雖然AM表面的光滑程度要優(yōu)于WPM，但AM中生成了許多破碎的微粒和形態(tài)不規(guī)則的聚集體，這說(shuō)明了WPM在呈球性和完整性上均要好于AM。

2.5 不同微膠囊對(duì)B.bif i dum F-35貯藏穩(wěn)定性的影響

圖3 兩種微膠囊對(duì)B. bi fi duumm F-35貯藏穩(wěn)定性的影響Fig.3 Stability of microencapsulated B.bi fi dum F-35 in two kinds of microcapsules during one month of storage at ambient temperature

由圖3可知，在常溫條件下貯藏30 d后發(fā)現(xiàn)，兩種微膠囊中B. bifidum F-35的存活量都有不同程度的下降，WPM從7.79（lg（CFU/g））下降到6.21（lg（CFU/g）），AM下降的趨勢(shì)更為明顯，在1 個(gè)月的貯藏期里，B.bifidum F-35的致死量接近2（lg（CFU/g））?？偟膩?lái)說(shuō)，包埋于WPM中的B.bifidum F-35的貯藏穩(wěn)定性要好于包埋于AM中的B.bif i dum F-35。

3 討 論

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化乳清蛋白交聯(lián)的反應(yīng)條件比較溫和，而且在WPM的制備過(guò)程中，不涉及到對(duì)益生菌細(xì)胞有毒害作用的CaCl2溶液，所以WPM的包埋效率要高于AM。凍干后，AM的呈球性和完整性上均要比WPM差，這是由于海藻酸鈉分子本身的柔軟性和易脆性所致[20]。

在模擬胃液中和貯藏期中，WPM對(duì)B.bifidum F-35具有較好保護(hù)效果的原因主要有兩點(diǎn)：1）乳清蛋白分子具有許多堿性的氨基酸殘基，所以在偏中性的環(huán)境中，乳清蛋白具有較高的緩沖能力，在WPM內(nèi)部，這些氨基酸殘基能夠中和滲透進(jìn)來(lái)的H+，從而維持一個(gè)pH值偏中性的內(nèi)部環(huán)境；2）由高質(zhì)量濃度（10 g/100 mL）的乳清蛋白溶液制備得到的微膠囊具有較高的物質(zhì)密度，所以WPM在呈球性和致密程度上均要優(yōu)于AM，這有助于延緩有害物質(zhì)滲透到微膠囊的內(nèi)部。相反，AM則很難由高質(zhì)量濃度的海藻酸鈉溶液制備得到，因?yàn)楹Ｔ逅徕c溶液的質(zhì)量濃度一旦超過(guò)2 g/100 mL，黏度就會(huì)急劇增加，從而影響微膠囊的制備。在高膽鹽環(huán)境中，WPM和AM保護(hù)效果相差不大的原因可能是：弱極性的膽鹽分子足夠大，以至于兩種微膠囊所形成的凝膠結(jié)構(gòu)均能有效延緩膽鹽的滲透。

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Comparison of Alginate and Whey Protein as Two Different Coating Materials Used for Probiotic Microencapsulation

ZOU Qiang1, LIANG Hua-zhong2, GONG Chun-xue1, TANG Ren-yong1,*
(1. Faculty of Biotechnology Industry, Chengdu University, Chengdu 610106, China; 2. Si Chuan Gao Fu Ji Biotechnology Co. Ltd., Chengdu 600732, China)

Two different microcapsules containing Bif i dobacterium bif i dum were individually prepared using alginate and whey protein. Their characteristics, including particle size, microencapsulation yield, micrographs, buffering capacity and protective effect on microencapsulated cells, were studied. The results showed that the particle size and microencapsulation yield of whey protein microcapsules (202.5 μm, 87.8%) were both higher than those of alginate microcapsules (118.3 μm, 48.1%). At high concentration of bile salt solution, there was no significant difference in protective effect on microencapsulated Bif i dobacterium bif i dum between these two microcapsules. However, the whey protein microcapsules provided a better protection for microencapsulated Bifidobacterium bifidum than alginate microcapsules did when treated with acid condition, simulated gastric juice and ambient storage condition, and the survival count of microencapsulated Bif i dobacterium bif i dum in whey protein microcapsules was 5, 2, and 0.5 (lg (CFU/mL)) higher than that in alginate microcapsules, respectively. There may be two reasons for this better protection: first, whey protein has higher buffering capacity at nearly neutral pH; and second, whey protein microcapsules have better micrographs in terms of sphericity and density.

whey protein; alginate; microcapsules; probiotics

TS201.1

A

1002-6630（2014）15-0207-05

10.7506/spkx1002-6630-201415042

2013-06-29

成都市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（12GGYB477NC）

鄒強(qiáng)（1982—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：zouqiang119@126.com

*通信作者：唐仁勇（1977—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：752360762@qq.com