富硒小麥提取物中硒含量及其抗氧化特性

趙 萍，劉笑笑，王 雅，張 軼，郭 濤

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

富硒小麥提取物中硒含量及其抗氧化特性

趙 萍，劉笑笑，王 雅，張 軼，郭 濤

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

為研究富硒小麥的富硒水平和硒的賦存形態(tài)，選用蘭州高硒地區(qū)生產(chǎn)的富硒小麥為原料，通過超聲、離心、透析的方法將富硒小麥中的有機(jī)硒和無機(jī)硒分離，用火焰原子吸收光譜法測(cè)定小麥硒水平。結(jié)果表明，富硒小麥硒的主要賦存形態(tài)是有機(jī)態(tài)，占總硒的84.36%。有機(jī)態(tài)硒主要為硒蛋白（54.46%），硒多糖次之，少量為硒核酸和其他有機(jī)態(tài)硒。在蛋白態(tài)硒中，清蛋白和谷蛋白硒含量較高，分別占總硒的19.46%和16.83%?？寡趸苑治鼋Y(jié)果表明，多糖相對(duì)于蛋白和核酸提取物，具有更長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間、更高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和Fe3+還原力。皮爾遜相關(guān)性分析表明，小麥富硒提取物抗氧化能力與其硒含量之間表現(xiàn)為顯著的正相關(guān)性。

富硒小麥；賦存形態(tài)；硒含量；火焰原子吸收光譜法；抗氧化能力

自由基理論認(rèn)為，在生物體內(nèi)，氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的羥自由基，可以引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷膜結(jié)構(gòu)及功能并引起各類疾病[1]，超氧陰離子與羥基結(jié)合后的產(chǎn)物能損傷生命大分子而導(dǎo)致各種疾病。自由基是引起機(jī)體衰老的根本原因，因此消除體內(nèi)多余自由基以延長(zhǎng)壽命已成為共識(shí)[2]。

硒是生物體必需的微量元素[3]，也是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成成分，它可以保護(hù)機(jī)體不受由自由基引起的氧化性損傷的損害[4]，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫機(jī)能和抗氧化性發(fā)揮重要作用[5-6]。硒缺乏會(huì)導(dǎo)致心臟病、肌肉萎縮和人體機(jī)能的紊亂，這些情況也同樣存在于一些動(dòng)物物種當(dāng)中[7]。通過膳食攝入硒（1 mg/d）是必需的[8]，但高濃度的硒會(huì)使人中毒。研究認(rèn)為有機(jī)硒比無機(jī)硒的毒性低且吸收率高，有機(jī)硒在體內(nèi)存在的形式主要有硒蛋白、硒多糖和硒核酸等[9]。

生長(zhǎng)在高硒土壤上的植物硒含量顯著高于缺硒或低硒土壤上生長(zhǎng)的同種植物。蘭州皋蘭地區(qū)屬于天然高硒地區(qū)，小麥?zhǔn)侵袊俗钪饕氖澄镏?。探討富硒小麥硒的賦存形態(tài)、富硒水平、抗氧化能力及之間的關(guān)系，能夠?yàn)槌浞珠_發(fā)和利用高硒地區(qū)的富硒小麥這一寶貴資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隴春3030富硒小麥 產(chǎn)地：甘肅河西地區(qū) 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；硒標(biāo)準(zhǔn)溶液 甘肅省質(zhì)監(jiān)局；Ni(NO3)2溶液：用體積分?jǐn)?shù)為1%的HNO3配制，質(zhì)量濃度為10 mg/mL；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；VC 天津市醫(yī)藥工業(yè)技術(shù)研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Z-5000火焰原子吸收光譜儀（帶火焰發(fā)生裝置、硒空心陰極燈） 日本島津公司；CAPY 50紫外-可見分光光度計(jì) 美國瓦里安公司；743油脂氧化儀 瑞士萬通公司；DG120粉碎機(jī) 瑞安市春海化學(xué)設(shè)備制造廠；TD-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀表制造廠；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 硒的測(cè)定方法

采用火焰原子吸收光譜法[10]，儀器工作主要參數(shù)為：硒空心陰極燈；波長(zhǎng)196 nm，燈電流14.5 mA，狹縫寬度1.3 nm，火焰高度12.5 mm，空氣流量5.0 L/min，乙炔流量1.5 L/min。

1.3.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別取0、1、3、4、6 mL 質(zhì)量濃度為100 ng/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于25 mL比色管中，加入1 mL Ni(NO3)2溶液（質(zhì)量濃度為10 mg/mL），定容至刻度。配制成質(zhì)量濃度為0、4、12、16、24 ng/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)液并測(cè)定吸光度。

1.3.2 富硒小麥樣品含硒量的測(cè)定

精確稱取待測(cè)樣品1.000 0 g于定氮瓶中，加數(shù)粒玻璃珠，緩慢加入10 mL混合酸（HNO3與HClO4體積比為4∶1），冷消化過夜后于電爐上消化至產(chǎn)生大量白煙，將消化液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，洗滌定氮瓶，合并洗液，加2 mL Ni(NO3)2溶液[11]，定容至刻度，測(cè)定硒含量。

1.3.3 無機(jī)硒含量的測(cè)定[12]

準(zhǔn)確稱取1.000 0g樣品，置于圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入用4 mol/L HCl 30 mL，然后于170 ℃條件下加熱，回流20 min，冷卻后用定量濾紙過濾雜質(zhì)，定容，得濾液，測(cè)得濾液中的硒含量即為樣品中無機(jī)硒含量。

1.4 富硒小麥富硒組分的提取

1.4.1 富硒小麥中蛋白組分的提取

1.4.1.1 富硒小麥中蛋白組分的提取工藝

1.4.1.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[13]。

1.4.2 富硒小麥中多糖組分的提取

1.4.2.1 富硒小麥中多糖組分的提取工藝

1.4.2.2 多糖的測(cè)定方法

采用苯酚-硫酸法[14-15]并在此方法基礎(chǔ)上加以改良。

1.4.3 富硒小麥中核酸組分的提取

1.4.3.1 富硒小麥中硒核酸的提取工藝

富硒小麥粉碎脫脂過篩→95 ℃水浴，NaCl提取→抽濾→濃縮上清液→脫蛋白→HCl調(diào)pH值至2.5→4 ℃靜置12 h→離心→95%乙醇淋澆沉淀→真空冷凍干燥→核酸粉末

1.4.3.2 硒核酸含量的測(cè)定

采用紫外吸收法測(cè)定核酸含量[16-17]。

1.5 提取液脫蛋白方法的選擇

分別采用Sevag法[18]和三氯乙酸法[18]對(duì)樣品提取液進(jìn)行脫蛋白，并比較兩種方法蛋白清除率和硒的損失率。

式中：T為粗提液中硒含量與總硒含量之比；T1為脫蛋白液硒含量與總硒含量之比。

式中：R為粗提液中蛋白百分含量；R1為脫蛋白液中蛋白百分含量。

1.6 抗氧化性的研究

將富硒小麥不同提取物進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，并與VC進(jìn)行比較。

1.6.1 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

通過測(cè)定被測(cè)化合物清除DPPH自由基的能力來分析樣品的抗氧化性。對(duì)參考文獻(xiàn)[19]作少量修改，精確吸取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2.000 mL，與2.000 mL質(zhì)量濃度0.025 mg/mL的DPPH溶液和2.000 mL無水乙醇混合，搖勻后放置30 min。以無水乙醇為對(duì)照，用分光光度計(jì)分別測(cè)定上述溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。用對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的VC作比較實(shí)驗(yàn)。

式中：Ai為樣液與DPPH溶液混合的吸光度；Aj為樣液的吸光度；A0為DPPH溶液的吸光度。

1.6.2 總還原力的測(cè)定

被測(cè)化合物的總還原力參考文獻(xiàn)[20]并作少量修改。分別取不同質(zhì)量濃度的樣液2.5 mL于試管中，以蒸餾水為空白對(duì)照，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）和2.5 mL 1 g/100 mL六氰合鐵酸鉀溶液，50 ℃水浴中保溫20 min，快速冷卻后加入2.5 mL 10%醋酸溶液。3 000 r/min條件下離心10 min。取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL 0.1 g/100 mL 三氯化鐵溶液，充分混勻，混合物靜止10 min后，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。以吸光度表示還原能力。用對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的VC作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.6.3 抗油脂氧化能力的測(cè)定

通過誘導(dǎo)時(shí)間來表示抗油脂氧化穩(wěn)定性。使用油脂氧化儀測(cè)定誘導(dǎo)時(shí)間[21]：110 ℃，空氣流速20 L/h。在每個(gè)反應(yīng)管中添加3.00 g豬油、提取物樣液和3 滴吐溫。誘導(dǎo)時(shí)間與抗氧化能力呈正相關(guān)，即誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng)，抗氧化能力越強(qiáng)。以VC作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過回歸分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.007 1x+0.005 4（R2=0.999 6）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=20.586 0x-0.005 8（R2=0.998 2）；硒標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.000 1x+0.004 7（R2=0.993 7）。

2.2 多糖提取液脫蛋白不同方法的比較

表1 兩種方法脫蛋白效果的比較Table 1 Comparison of the efficiency of two methods for protein removal

由表1可知，Sevag法具有較高的脫蛋白率和較低的硒損失率，通過方差分析得出2 種方法的脫蛋白率具有顯著性差異（P＜0.001），硒損失率也具有顯著性差異（P＜0.005），因此本實(shí)驗(yàn)采用Sevag法對(duì)粗多糖進(jìn)行脫蛋白。

2.3 富硒小麥中硒的賦存研究

2.3.1 硒在小麥籽粒中的賦存水平

用火焰原子法測(cè)定小麥各組分硒含量可知，富硒小麥粉的總硒含量為（41.14±0.02）ng/g，其中硒主要以有機(jī)態(tài)存在，其含量為（34.65±0.03）ng/g，占總硒量的8 4.3 6%，無機(jī)硒提取物硒含量為（6.49±0.04）ng/g。由表2可知，富硒小麥中硒的主要賦存形態(tài)為：蛋白態(tài)硒、多糖態(tài)硒、核酸態(tài)硒。蛋白態(tài)硒主要結(jié)合于小麥的4 種蛋白質(zhì)中，分別占有機(jī)硒比例為：麥清蛋白23.04%、麥球蛋白12.68%、麥醇蛋白為11.20%、麥谷蛋白19.93%。多糖態(tài)硒的3 種提取物硒含量分別占有機(jī)硒比例為：堿溶性多糖2.83%、水溶性多糖9.03%、酸溶性多糖4.42%。富硒小麥中硒主要賦存形態(tài)按含硒量大小依次排序?yàn)椋蝴溓宓鞍住Ⅺ湽鹊鞍?、麥球蛋白、水溶性多糖、麥醇蛋白、酸溶性多糖、核酸提取物、堿溶性多糖。

表2 富硒小麥不同賦存形態(tài)硒含量（以絕干計(jì)）Table 2 Comparison of Se levels and speciation in Se-enrich wheat (on a dry matter basis)

2.3.2 硒在小麥籽粒各組分中的分布比例

圖1 硒在小麥籽粒中的分布比例Fig.1 Distribution of selenium species in Se-enriched wheat

由圖1可知，富硒小麥硒含量主要為有機(jī)形式存在，占總硒量的84.36%；其中蛋白結(jié)合態(tài)硒占總硒含量高達(dá)54.46%，說明小麥籽粒中有機(jī)態(tài)硒主要是以硒蛋白的形式存在，多糖結(jié)合態(tài)硒占總硒15.75%，其他少量硒賦存于硒核酸和其他有機(jī)形式硒中。

2.4 抗氧化性的測(cè)定結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基清除能力的比較

圖2 不同小麥提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activities of organic Se compounds extracted from Se-enriched wheat

圖3 不同溶解性硒蛋白提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activities of different Se-binding proteins extracted from Se-enriched wheat

由圖2、3可知，富硒小麥含硒提取物對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力。以半數(shù)抑制量IC50值來評(píng)價(jià)樣品清除自由基能力，IC50值越高表明樣品清除自由基的能力越差，抗氧化性也就越差，DPPH自由基清除能力大小為：VC＞多糖提取物＞蛋白提取物＞核酸提取物。不同溶解性硒蛋白的抗氧化性強(qiáng)弱順序?yàn)椋蝴溓宓鞍祝↖C50=0.914 mg/mL）＞麥谷蛋白（IC50=0.974 mg/mL）＞麥球蛋白（IC50=1.061 mg/mL）＞麥醇蛋白（IC50=1.214 mg/mL）。

2.4.2 總還原力的比較

圖4 不同小麥提取物的總還原力Fig.4 Total reducing power of organic Se compounds extracted from Se-enriched wheat

圖5 不同溶解性蛋白提取物的總還原力Fig.5 Total reducing power of different Se-binding proteins extracted from Se-enriched wheat

由于吸光度大小與抗氧化性強(qiáng)弱成正相關(guān)，由圖4、5可知，抗氧化性強(qiáng)弱關(guān)系為：VC＞多糖提取物＞蛋白質(zhì)提取物＞核酸提取物。樣品質(zhì)量濃度增加，吸光度也隨之增加，吸光度越高表明抗氧化性越強(qiáng)。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，VC和蛋白提取物抗氧化性強(qiáng)弱的順序?yàn)椋蝴溓宓鞍祝钧湽鹊鞍祝钧溓虻鞍祝钧湸嫉鞍住?/p>

2.4.3 抗油脂氧化穩(wěn)定性

圖6 不同小麥提取物對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間的影響Fig.6 Influence of different samples on induction time

由圖6可知，不同的硒提取物的誘導(dǎo)時(shí)間有一定的差異，通過單因素方差分析得出抗氧化能力由強(qiáng)到弱排列：VC＞多糖提取物＞麥清蛋白＞麥谷蛋白＞麥球蛋白＞麥醇蛋白＞核酸提取物＞空白，與清除DPPH自由基能力和總還原力的測(cè)定結(jié)果一致。

2.5 抗氧化活性與硒含量的關(guān)系

表3 富硒小麥含硒提取物抗氧化活性與其硒含量的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of antioxidant activity with selenium content in different extracts of Se-enriched wheat

為了進(jìn)一步了解小麥富硒提取物抗氧化活性和其硒含量之間的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)分析了兩者之間的皮爾遜（Pearson）相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表3所示，小麥中富硒提取物抗氧化性與其硒含量之間的相關(guān)性表現(xiàn)為顯著的正相關(guān)性。表明富硒提取物中的硒對(duì)其抗氧化作用具有顯著增強(qiáng)作用。

3 結(jié) 論

富硒小麥籽粒中硒主要以有機(jī)態(tài)存在，占總硒的84.36%。有機(jī)態(tài)硒中以蛋白硒（54.46%）為主要賦存形式，硒多糖次之，少量為硒核酸和其他有機(jī)態(tài)硒。在蛋白質(zhì)結(jié)合硒中，清蛋白和谷蛋白中硒含量較高，分別占總硒的19.46%和16.83%；抗氧化性分析結(jié)果表明，硒多糖相對(duì)于蛋白和核酸提取物，具有更強(qiáng)的抗氧化能力，主要是由于它具有更長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間、更高的DPPH自由基清除能力和總還原力，這可能與多糖本身含有一些未知的具有抗氧化活性的成分有關(guān)。富硒蛋白提取物抗氧化活性依次為：麥清蛋白＞麥谷蛋白＞麥球蛋白＞麥醇蛋白。核酸提取物抗氧化能力不顯著。富硒小麥蛋白、多糖以及核酸提取物中硒的化學(xué)結(jié)構(gòu)目前來說仍不明確，硒對(duì)小麥油脂等其他有機(jī)部位的作用尚未研究，需要進(jìn)一步的研究來確定在富硒小麥含硒提取物中硒的結(jié)構(gòu)。

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Selenium Content and Antioxidant Activity of Selenium-Enriched Wheat

ZHAO Ping, LIU Xiao-xiao, WANG Ya, ZHANG Yi, GUO Tao
(School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)

In order to investigate selenium (Se) levels and speciation in Se-enriched wheat, organic and inorganic selenium (Se) from wheat samples grown in Lanzhou were separated by ultrasonic pretreatment, centrifugation and dialysis and determined by flame atomic absorption spectrometry. The results showed that Se existed mainly in organic form, accounting for 84.36% of the total Se in Se-enriched wheat. The organic Se was mainly bound to protein (54.46%), followed by polysaccharide, and a small amount of Se was bound to nucleic acid or other organic components. Albumin and glutelin comprised 19.46% and 16.83% of total Se-containing proteins, respectively. The results of antioxidant activity showed that the polysaccharides had longer induction time and higher 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and reducing activity than protein extracts and nucleic acid extracts. Pearson correlation analysis indicated that the antioxidant capacity of Se-enriched wheat extracts had a significant positive correlation with Se contents.

selenium-enriched wheat; speciation; selenium content; flame atomic absorption spectrometry; antioxidant capacity

TS210.7

A

1002-6630（2014）15-0094-05

10.7506/spkx1002-6630-201415019

2013-04-16

甘肅省自然科學(xué)研究基金計(jì)劃項(xiàng)目（0803RJZA044）

趙萍（1964—），女，教授，碩士，主要從事食品科學(xué)、副產(chǎn)物綜合利用研究。E-mail：pinhzhaogdqg@163.com