桃紅四物湯對(duì)產(chǎn)后血瘀證大鼠Rho／ROCK通路RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表達(dá)的影響

李白坤，朱繼民，梁 杰，劉竹青，李珊珊，彭代銀

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽合肥 230038）

桃紅四物湯對(duì)產(chǎn)后血瘀證大鼠Rho／ROCK通路RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表達(dá)的影響

李白坤1，2，朱繼民2，梁 杰1，劉竹青1，李珊珊1，彭代銀1

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽合肥 230038）

目的 探討桃紅四物湯治療產(chǎn)后血瘀證的作用機(jī)制。方法 采用米非司酮（8.3mg／kg）和米索前列醇（0.1mg／kg）灌胃早孕鼠，復(fù)制血瘀證產(chǎn)后大鼠模型，將模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（法舒地爾，10mg／kg）及桃紅四物湯組（9.0g／kg），并設(shè)立正常對(duì)照組；通過(guò)觀察大鼠子宮形態(tài)及血液流變學(xué)指標(biāo)變化評(píng)價(jià)桃紅四物湯治療產(chǎn)后血瘀證的療效，采用免疫印跡法測(cè)定ras同源基因A（ras homolog gene，member A，RhoA）、磷酸化RhoA（phospho－RhoA，p－RhoA）蛋白及纖溶酶原激活劑抑制物（plasminogen activator inhibitor－1，PAI－1）的表達(dá)水平。結(jié)果 桃紅四物湯能夠明顯減輕模型大鼠子宮的炎性反應(yīng)及紅細(xì)胞的滲出和聚集，降低全血黏度和血漿黏度（P＜0.05，或P＜0.01），下調(diào)p－RhoA及PAI－1蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01）。結(jié)論 桃紅四物湯治療產(chǎn)后血瘀證的機(jī)制與下調(diào)Rho／ROCK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。

桃紅四物湯；Rho／ROCK通路；血瘀證

根據(jù)中醫(yī)學(xué)“若瘀血不去，則新血不生”（唐容川《血證論·產(chǎn)血》）的病機(jī)，臨床實(shí)踐證實(shí)只有活血祛瘀才能達(dá)到祛瘀生新的目的。桃紅四物湯對(duì)血瘀證的療效已為許多研究［1－3］證實(shí)，且其對(duì)血瘀證的治療作用可能與溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）含量有關(guān)［4］。研究顯示，血液中LPA的含量可在一定程度上反映血瘀證的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，且可通過(guò)G12／13蛋白激活ras同源基因（ras homolog gene，Rho）／Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiled coil－forming protein kinase，ROCK）通路［5－6］；而Rho／ROCK信號(hào)通路能參與調(diào)節(jié)一些常見(jiàn)心腦血管疾病的病理過(guò)程，在參與血栓性疾病中扮演著重要的角色［78］。故推測(cè)桃紅四物湯的活血祛瘀作用可能與Rho／ROCK通路有關(guān)，但目前尚未見(jiàn)到相關(guān)研究報(bào)道。本研究以產(chǎn)后血瘀證大鼠為研究對(duì)象，從分子水平觀察桃紅四物湯對(duì)Rho／ROCK信號(hào)通路ras同源基因A（ras homolog gene family，member A，RhoA）、磷酸化RhoA（phospho－RhoA，p－RhoA）蛋白及纖溶酶原激活劑抑制物（plasminogen activator inhibitor－1，PAI－1）表達(dá)水平的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠100只，雌性70只，雄性30只，鼠齡10月齡，體質(zhì)量（230±20）g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（皖）2011－002。

1.2 藥物 桃紅四物湯（桃仁、當(dāng)歸、白芍各9g，紅花、川芎各6g，熟地黃12g）購(gòu)自安徽省合肥樂(lè)家老鋪中藥飲片有限公司。先將藥材用10倍于生藥材量的雙蒸水浸泡1h，然后再煎煮2次（每次先武火煮沸20min，再文火煎煮40min），最后再濃縮至0.9g／ml。米非司酮片由北京紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)43110811；米索前列醇片由北京紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)43110111。RhoA、p－RhoA及PAI－1抗體購(gòu)自Bioworld公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制與給藥 隨機(jī)留取10只雌性大鼠作為正常對(duì)照組，其余大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后雌鼠與雄鼠以2∶1合籠，次日晨進(jìn)行陰道栓和陰道涂片鏡檢，以發(fā)現(xiàn)陰道栓和精子的當(dāng)天為妊娠第1天。于妊娠第7天分別灌胃米非司酮（8.3mg／kg，上午8點(diǎn)）和米索前列醇（0.1mg／kg，下午6點(diǎn)）復(fù)制模型［8］。通過(guò)血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)的變化判斷產(chǎn)后血瘀模型是否復(fù)制成功［9］。選取模型復(fù)制成功的大鼠27只，隨機(jī)分為3組，每組9只。即桃紅四物湯組（桃紅四物湯9.0g／kg，相當(dāng)于成人臨床用量的10倍），陽(yáng)性對(duì)照組（法舒地爾10mg／kg）和模型組（生理鹽水）。自由飲食，采用灌胃方式給藥（10ml／kg），每日2次，連續(xù)7d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 標(biāo)本采集：末次給藥1h后，將全部大鼠用35g／L水合氯醛（10ml／kg）腹腔注射麻醉，切開(kāi)腹腔暴露腹主動(dòng)脈，穿刺腹主動(dòng)脈取血并抗凝，取適量抗凝血用于血流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。迅速取出Y形子宮并剪開(kāi)，一側(cè)放入10％中性甲醛中固定24h，石蠟包埋后用于形態(tài)學(xué)觀察；另一側(cè)子宮標(biāo)本用濾紙吸干后，立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱中凍存，用于相關(guān)蛋白檢測(cè)。

2.2.2 指標(biāo)檢測(cè)：采用旋轉(zhuǎn)式血液流變儀檢測(cè)血液黏度指標(biāo)，包括全血低切變率黏度（5s－1）、全血中切變率黏度（30s－1）、全血高切變率黏度（200s－1）、血漿黏度。將大鼠子宮石蠟包埋標(biāo)本切片，行蘇木精－伊紅（haematoxylin－eosin，HE）染色，借助顯微鏡（日本Nikon 80i）觀察子宮病理改變。采用免疫印跡法檢測(cè)RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。呈正態(tài)分布的連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。模型組與對(duì)照組均數(shù)比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組（除正常對(duì)照外）間各指標(biāo)均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用SNK檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 桃紅四物湯對(duì)大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響 模型組大鼠的全血黏度和血漿黏度均較正常對(duì)照組顯著增加（P＜0.05，或P＜0.01）；而桃紅四物湯組大鼠全血低切黏度、高切黏度及血漿黏度較模型組則顯著降低（P＜0.05，或P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組 別n全血黏度／（mPa·s）5s－1 30s－1 200s－1血漿黏度／（mPa·s）正常對(duì)照10 12.53±1.63 6.34±0.54 4.44±0.39 1.55±0.06模 型9 14.64±2.02＊6.93±0.55＊4.92±0.34＊1.90±0.06＊＊桃紅四物湯9 12.59±1.14＃6.44±0.59 4.40±0.32＃＃1.57±0.12＃＃

3.2 桃紅四物湯對(duì)大鼠子宮形態(tài)的影響 正常對(duì)照組子宮內(nèi)膜腺體較大，腺腔未見(jiàn)明顯擴(kuò)張，腺細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)胞漿空泡，間質(zhì)無(wú)水腫，血管切面較小，呈較規(guī)則圓形，無(wú)充血，其管腔內(nèi)無(wú)紅細(xì)胞聚集。模型組子宮內(nèi)膜腺體較小，但間質(zhì)稍顯水腫，并見(jiàn)少量紅細(xì)胞滲出，血管切面較大、擴(kuò)張、充血，其管腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞聚集。桃紅四物湯組子宮內(nèi)膜腺體較小，其間質(zhì)無(wú)明顯水腫，血管切面也較小，呈圓形，其管腔內(nèi)僅見(jiàn)少量紅細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖2 Western－blotting法檢測(cè)各組RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表達(dá)水平

注：A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.桃紅四物湯組。圖1 各組大鼠子宮的組織形態(tài)變化（HE染色，10×10倍）

表2 各組大鼠RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組 別n RhoA p－RhoA PAI－1正常對(duì)照10 0.507±0.119 0.419±0.110 0.363±0.092模 型9 0.512±0.120 1.955±0.420＊＊2.146±0.460＊＊陽(yáng)性對(duì)照9 0.489±0.117 1.564±0.322＃1.365±0.271＃＃桃紅四物湯9 0.426±0.108 1.225±0.252＃?！?.489±0.268＃＃

3.3 各組RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表達(dá)水平比較 模型組大鼠子宮p－RhoA及PAI－1蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著增加（P＜0.01）。桃紅四物湯組與陽(yáng)性對(duì)照組p－RhoA及PAI－1蛋白表達(dá)水平較模型組顯著降低（P＜0.05，或P＜0.01），藥物組p－RhoA蛋白表達(dá)水平顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。各組RhoA蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2和表2。

4 討論

桃紅四物湯為中醫(yī)臨床廣泛使用的活血祛瘀代表方劑之一，但其作用機(jī)制至今尚未完全闡明。前期研究結(jié)果提示，桃紅四物湯對(duì)血瘀證的治療作用可能與其降低血液中LPA含量有關(guān)，且劑量為9.0 g／kg時(shí)其作用更顯著［4］，這也是本研究?jī)H設(shè)置一個(gè)藥物劑量的依據(jù)。同時(shí)有研究提示，LPA能通過(guò)G12／13蛋白激活Rho／ROCK信號(hào)通路，進(jìn)而激活該通路下游纖溶系統(tǒng)相關(guān)效應(yīng)蛋白PAI－1而發(fā)揮作用［10］。

本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠子宮腺體縮小，間質(zhì)水腫，紅細(xì)胞滲出，血管充血，血管腔內(nèi)出現(xiàn)紅細(xì)胞聚集等，其全血黏度和血漿黏度均較正常對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），這些提示產(chǎn)后血瘀證大鼠模型復(fù)制成功。與模型組比較，桃紅四物湯組大鼠子宮炎性反應(yīng)明顯減輕，紅細(xì)胞滲出及聚集輕微，全血黏度（低切、高切）和血漿黏度顯著降低（P＜0.05），這些提示桃紅四物湯對(duì)產(chǎn)后血瘀證具有較好的治療作用。免疫印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桃紅四物湯能在一定程度上抑制血瘀證大鼠p－RhoA及PAI－1蛋白的表達(dá)。結(jié)合前期的研究結(jié)果［4］，說(shuō)明桃紅四物湯治療產(chǎn)后血瘀證的機(jī)制與其干預(yù)LPA－Rho／ROCKPAI－1信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示桃紅四物湯治療產(chǎn)后血瘀證的科學(xué)內(nèi)涵提供了參考。

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Effect of Taohong Siwu Decoction on Protein Expression of RhoA，p－RhoA，and PAI－1in Rho／ROCK Pathway in Postpartum Rats with Blood Stasis Syndrome

LI Bai－kun1，2，ZHU Ji－min2，LIANG Jie1，LIU Zhu－qing1，LI Shan－shan1，PENG Dai－yin1
（1.School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine ＆Anhui Province Key Laboratory of R＆D of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230031，China；2.Clinical School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China）

Objective To investigate the effect of Taohong Siwu Decoction（TSD）on the protein expression of ras homolog gene family，member A（RhoA），phospho－RhoA（p－RhoA），and plasminogen activator inhibitor－1（PAI－1）in the Rho／ROCK pathway in postpartum rats with blood stasis syndrome（BSS）.Methods A postpartum rat model of BSS was induced by intragastric administration of mifepristone（8.3 mg／kg）and misoprostol（0.1mg／kg）in early pregnant rats.The model rats were randomly divided into model group，positive control group，and TSD group，and the positive control group and TSD group received fasudil（10mg／kg）and TSD（9.0g／kg），respectively；normal female rats were selected as normal control group.The efficacy of TSD in the treatment of postpartum BSS was evaluated based on the changes in uterus morphology and hemorheological indices.The protein expression levels of RhoA，p－RhoA，and PAI－1were determined by Western blotting.Results Compared with the model group，the TSD group had significantly reduced inflammatory response of the uterus and exudation and aggregation of erythrocytes，significantly decreased blood viscosity and plasma viscosity（P＜0.05or P＜0.01），and significantly down－regulated protein expression of p－RhoA and PAI－1（P＜0.01）.Conclusion TSD is effective in the treatment of postpartum BSS，which is related to the down－regulation of p－RhoA and PAI－1in the Rho／ROCK pathway.

Taohong Siwu Decoction；Rho／ROCK pathway；blood stasis syndrome

R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.022

2013－10－15）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81073091）；安徽中醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2011zr006B）

李白坤（1979－），女，碩士，講師

彭代銀，pengdy＠ahtcm.edu.cn