亳菊總黃酮對(duì)大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用

沈炳香，王桐生，魏慶紅，李 莉，吳金爽，余貴媛，吳德玲，5

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院，安徽六安 237005；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽合肥 230038；3.現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031；4.安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，安徽亳州 236821；5.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科技處，安徽合肥 230038）

亳菊總黃酮對(duì)大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用

沈炳香1，王桐生2，3，魏慶紅4，李 莉2，吳金爽3，余貴媛2，吳德玲3，5

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院，安徽六安 237005；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽合肥 230038；3.現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031；4.安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，安徽亳州 236821；5.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科技處，安徽合肥 230038）

目的 研究亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心臟的保護(hù)作用，為其進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 將SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組，模型組，復(fù)方丹參滴丸組（140mg／kg），亳菊總黃酮小、中、大劑量組（分別為75、150、300mg／kg）。采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法復(fù)制大鼠急性心肌缺血模型。分別于手術(shù)前，手術(shù)后0、0.5、1.0、2.0h測定各組大鼠心電圖ST段變化；冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后24h測定血清天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）含量；觀察各組大鼠心肌梗死率及心肌組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 亳菊總黃酮可降低急性心肌缺血大鼠各時(shí)點(diǎn)心電圖ST段抬高值，降低血清AST、LDH、CK含量，降低心肌梗死率，改善心肌組織形態(tài)學(xué)變化，呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)。結(jié)論 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心臟有一定的保護(hù)作用。

急性心肌缺血；亳菊花；總黃酮；天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶；乳酸脫氫酶酶；肌酸激酶

亳菊花為安徽道地藥材，具有疏風(fēng)散熱、解暑明目的功效，為醫(yī)家首選菊花品種之一，黃酮類、揮發(fā)油等為其主要活性成分［1］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物對(duì)心肌缺血及缺血再灌注有明顯的保護(hù)作用，對(duì)心、腦、血管疾病有一定的預(yù)防作用［2－4］。本實(shí)驗(yàn)采用大孔樹脂純化技術(shù)，分離提取亳菊總黃酮，觀察其對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心臟的保護(hù)作用，為其進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要藥物及試劑 亳菊總黃酮：采用乙醇回流提取2次，再用AB－8型大孔樹脂富集純化，以蘆丁為對(duì)照品，采用比色法測定，總黃酮含量為76.3％，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室提供，批號(hào)20121205。復(fù)方丹參滴丸：天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)110361。紅四氮唑（red tetrazoline，TTC）：BIOSHARP公司生產(chǎn)，批號(hào)0765。天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）檢測試劑盒：均購自德國德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司，批號(hào)26025／9620191。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（皖）2011－002號(hào)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 AU2700型貝克曼生化分析儀：日本。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型復(fù)制［5－6］取體質(zhì)量為200～250g雄性大鼠，隨機(jī)分成假手術(shù)組，模型組，復(fù)方丹參滴丸組（140mg／kg），亳菊總黃酮小、中、大劑量組（分別為75、150、300mg／kg，用0.5％的羧甲纖維素鈉混懸），每組14只。各給藥組大鼠按相應(yīng)劑量灌胃給藥，假手術(shù)組、模型組給予等容積羧甲纖維素鈉溶液，10ml／kg，每天1次，連續(xù)7d。末次給藥后30min，各組大鼠用乙醚麻醉，于左第4肋間開胸，暴露心臟，以5－0號(hào)線距左冠狀動(dòng)脈根部2～3 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，閉胸，造成急性心肌梗死模型，以心電圖顯示ST段弓背形抬高或T波抬高為急性心肌梗死模型成功標(biāo)志（成功率約80％），假手術(shù)組作相應(yīng)處理但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

2.2 檢測指標(biāo)

2.2.1 對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心電圖ST段的影響：乙醚麻醉動(dòng)物，分別測定各組大鼠（n＝10）手術(shù)前和手術(shù)后0、0.5、1.0、2.0h的心電圖（采用Ⅱ?qū)?lián)心電圖，走紙速度50mm／s）。與手術(shù)前比較，計(jì)算術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)ST抬高值。

2.2.2 對(duì)急性心肌缺血模型大鼠血清相關(guān)酶的影響：結(jié)扎后24h，各組動(dòng)物用10％水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，檢測心肌AST、LDH、CK水平。

2.2.3 急性心肌缺血模型大鼠心肌梗死率測定及病理改變觀察：每組取6只大鼠，迅速取出心臟，剔除心房組織，將剩余心室組織切成3～4mm厚的薄片，置于1％TTC的磷酸鹽緩沖液（pH值＝7.4，36.5～37.5℃）染色15min，稱取整個(gè)心肌及梗死區(qū)心?。ㄈ旧驶野咨┵|(zhì)量，計(jì)算梗死率。取部分結(jié)扎以下至心尖部位的心臟（n＝4），10％中性甲醛溶液固定，常規(guī)蘇木精－伊紅（hematoxylin－eosin，HE）染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較采用SNK法（方差齊）或Tamhane法（方差不齊）進(jìn)行檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心電圖ST段的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠各時(shí)點(diǎn)心電圖ST段抬高值顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組和亳菊總黃酮不同劑量組大鼠心電圖ST段抬高值均有不同程度下降，隨著亳菊總黃酮?jiǎng)┝吭黾雍妥饔脮r(shí)間延長，心電圖ST段抬高值下降越明顯，其中亳菊總黃酮中、大劑量組在術(shù)后1.0、2.0h心電圖ST段抬高值顯著低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心電圖ST段抬高值的影響（±s）

表1 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心電圖ST段抬高值的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

組 別n ST段抬高值／2.0h假手術(shù)mV術(shù)后0h術(shù)后0.5h術(shù)后1.0h術(shù)后10 0.17±0.19 0.10±0.11 0.10±0.10 0.09±0.11模 型10 0.45±0.17＊0.39±0.15＊0.37±0.12＊0.32±0.13＊復(fù)方丹參滴丸10 0.23±0.11＃0.19±0.11＃0.25±0.14 0.20±0.15亳菊總黃酮（?。?0 0.40±0.09 0.30±0.19 0.33±0.15 0.27±0.16亳菊總黃酮（中）10 0.31±0.27 0.26±0.19 0.20±0.11＃0.19±0.11＃亳菊總黃酮（大）10 0.29±0.18 0.21±0.12＃0.19±0.13＃0.18±0.12＃

3.2 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌梗死率的影響 各組全心質(zhì)量和心室肌質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組及亳菊總黃酮中、大劑量組大鼠梗死心肌質(zhì)量及心肌梗死率顯著降低（P＜0.05）。見表2。

3.3 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠血清AST、LDH、CK水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清AST、LDH、CK水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組大鼠血清AST、CK水平，亳菊總黃酮小劑量組大鼠血清AST、LDH水平，以及亳菊總黃酮中、大劑量組大鼠血清AST、LDH和CK水平均顯著降低（P＜0.05）；亳菊總黃酮在降低AST、LDH和CK方面呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性，其中亳菊總黃酮大劑量組大鼠血清CK水平顯著低于亳菊總黃酮小劑量組（P＜0.05）。見表3。

表2 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心肌梗死率的影響（±s）

表2 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心肌梗死率的影響（±s）

注：與模型組比較，＃P＜0.05。

組 別n全心質(zhì)量／mg心室肌質(zhì)量／mg梗死心肌質(zhì)量／mg心肌梗死率／％假手術(shù)6 847.2±114.3 661.0±69.5模 型6 914.4±81.0 611.3±43.5 150.9±31.6 24.68±5.89復(fù)方丹參滴丸6 843.1±108.3 592.4±86.1 75.1±14.8＃12.67±1.30＃亳菊總黃酮（小）6 889.6±84.1 593.5±78.7 131.6±28.7 22.17±4.21亳菊總黃酮（中）6 895.8±84.1 612.5±91.3 91.2±52.0＃14.89±6.18＃亳菊總黃酮（大）6 841.4±62.1 595.6±53.3 80.4±26.3＃13.49±3.09＃

表3 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠血清AST、LDH、CK水平的影響（±s）

表3 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠血清AST、LDH、CK水平的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與亳菊總黃酮小劑量組比較，△P＜0.05。

組 別n AST／（U／L）LDH／（U／L）CK／（U／ml）假手術(shù)10 180.50±70.13 349.00±106.97 270.99±74.53模 型10 589.50±204.26＊791.20±155.19＊494.20±100.79＊復(fù)方丹參滴丸10 303.10±115.57＃629.00±298.96 376.80±89.09＃亳菊總黃酮（?。?0 406.67±151.67＃551.50±183.86＃462.02±68.63亳菊總黃酮（中）10 364.14±128.53＃415.29±108.16＃365.09±59.30＃亳菊總黃酮（大）10 327.40±123.60＃423.07±139.21＃316.80±86.17?！?/p>

3.4 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心肌病理改變的影響 假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，核呈圓或橢圓形，染色質(zhì)均勻分布。模型組大鼠心肌細(xì)胞多灶性、片狀凝固性壞死，核溶解、碎裂，部分區(qū)域細(xì)胞核消失，細(xì)胞質(zhì)染色加深，間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血明顯，組織疏松水腫，伴大量中性粒細(xì)胞浸潤。復(fù)方丹參滴丸組大鼠心肌細(xì)胞灶性凝固性壞死，范圍較模型組小，核溶解、碎裂，局部區(qū)域細(xì)胞核消失，細(xì)胞質(zhì)染色加深，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血。亳菊總黃酮組大鼠心肌細(xì)胞呈點(diǎn)狀、小灶狀凝固性壞死，范圍較小，其中中劑量組和大劑量組的病變明顯減輕，部分心臟以心肌變性為主，梗死不明顯。見圖1。

4 討論

采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法復(fù)制大鼠急性心肌缺血模型，是目前評(píng)價(jià)抗心肌缺血藥物療效最常用的方法。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后，大鼠血流動(dòng)力學(xué)和心肌代謝的改變與冠心病患者嚴(yán)重心肌缺血有某些相似之處，因此該模型適合藥效學(xué)研究，用于判斷用藥前后缺血范圍的變化［7］。LDH和CK是目前臨床上診斷急性心肌梗死的較好指標(biāo)，LDH是機(jī)體能量代謝的一種重要的酶，當(dāng)心肌損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)酶被釋放出來并擴(kuò)散入血漿，測定該酶活性可在一定程度上反映缺血心肌的病變。CK也廣泛存在于心肌中，當(dāng)心肌細(xì)胞損傷時(shí)，血清中CK活性增加，可迅速反映心肌損傷情況。LDH、CK是評(píng)估心肌缺血程度和判斷心肌細(xì)胞從可逆到不可逆損傷的重要指標(biāo)［8］。

圖1 亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血模型大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化的影響（HE染色，10×20倍）

亳菊為安徽道地藥材，其味甘、苦、微寒。歸肺、肝經(jīng)，具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒的功效［9］。對(duì)亳菊化學(xué)成分的研究及其總黃酮的提取分離的研究較為深入［10－11］，但對(duì)其功效研究報(bào)道甚少。本研究采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法復(fù)制急性心肌缺血模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亳菊總黃酮能顯著降低模型動(dòng)物心電圖ST段抬高值，降低心肌酶活性，減少心肌梗死面積并對(duì)心肌病理改變有一定的改善作用，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［12］一致。

綜上所述，亳菊總黃酮對(duì)急性心肌缺血有明顯的保護(hù)作用，該研究對(duì)其開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其保護(hù)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Cardioprotective Effect of Total Flavonoids in Chrysanthemum morifoliumRamat.from Bozhou in Rats with Acute Myocardial Ischemia

SHEN Bing－xiang1，WANG Tong－sheng2，3，WEI Qing－h(huán)ong4，LI Li2，WU Jin－shuang3，YU Gui－yuan2，WU De－ling3，5
（1.Lu'an Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Anhui Lu'an 237005，China；2.Clinical School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China；3.Anhui Key Laboratory for Modern Chinese Materia Medica，Anhui Hefei 230031，China；4.Anhui Xiehecheng Co.，Ltd.，Anhui Bozhou 236821，China；5.Department of Science and Technology，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China）

Objective To study the cardioprotective effect of total flavonoids in Chrysanthemum morifoliumRamat.from Bozhou in rats with acute myocardial ischemia and to provide an experimental basis for the development of related drugs.Methods Male Sprague－Dawley rats were randomly divided into sham operation group，model group，compound Danshen dripping pill group（140mg／kg），and low－，middle－，and high－dose total flavonoids groups（75，150，and 300mg／kg）.A rat model of acute myocardial ischemia was induced by coronary artery ligation.Electrocardiography was performed before and at 0，0.5，1.0，and 2.0hafter operation to evaluate ST segment changes.Serum levels of aspartate aminotransferase（AST），lactate dehydrogenase（LDH），and creatine kinase（CK）were measured at 24hafter coronary artery ligation.The rate of myocardial infarction and myocardial tissue were determined and observed.Results For rats with acute myocardial ischemia，total flavonoids in Chrysanthemum morifoliumRamat.from Bozhou reduced ST segment elevation at each time point，decreased serum levels of AST，LDH，and CK，reduced the rate of myocardial infarction，and improved myocardial tissue，with a certain dose－effect relationship.Conclusion Total flavonoids in Chrysanthemum morifoliumRamat.from Bozhou have a cardioprotective effect in the rat model of acute myocardial ischemia.

acute myocardial ischemia；Chrysanthemum morifolium Ramat.from Bozhou；total flavonoids；aspartate aminotransferase；lactate dehydrogenase；creatine kinase

R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.021

2013－10－12）

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BA104B04）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81303229）；安徽省年度科研項(xiàng)目（1301043016）

沈炳香（1972－），女，副主任藥師

吳德玲，dlwu7375＠sina.com