間充質(zhì)干細(xì)胞成平滑肌分化治療應(yīng)用的研究進(jìn)展

黃 懿，丁留成綜述，衛(wèi)中慶審校

0 引 言

臨床許多疾病如膀胱收縮功能障礙、血管損傷等引起平滑肌組織功能障礙，其治療手段單一、療效欠佳。近年來，組織工程作為“再生醫(yī)學(xué)”逐漸進(jìn)入到此類疾病研究中，干細(xì)胞是其廣泛研究和利用的一種手段。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是干細(xì)胞的一種，具有自我更新、多向分化和歸巢的能力，在特定的體內(nèi)外環(huán)境下，能夠誘導(dǎo)分化成為多種組織細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。MSCs強(qiáng)大的增殖分化能力以及其來源廣泛、取材容易、擴(kuò)增能力強(qiáng)、免疫原性低、容易進(jìn)行自體移植等特點(diǎn)使其逐漸成為治療人類多種疾病潛在的種子細(xì)胞。

迄今為止，MSCs在細(xì)胞治療及組織工程中得到了諸多應(yīng)用［1-3］，但MSCs移植應(yīng)用于治療面臨兩方面問題:①M(fèi)SCs移植后在局部組織中定植、存活的效率難以保證;②定向分化效率問題，MSCs具有向多種組織分化的潛能，但在移植組織內(nèi)，MSCs的生存環(huán)境發(fā)生改變，移植后能否向我們期望的方向分化。如何提高M(jìn)SCs移植后在局部病理環(huán)境中的耐受性，增加細(xì)胞歸巢定植數(shù)量，現(xiàn)就此方面的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 MSCs在組織中的歸巢定植

所謂MSCs歸巢，指自體的或者外源性MSCs在多種因素作用下，定向趨化遷移至靶器官的病變或損傷組織。這是MSCs有望應(yīng)用于臨床治療的重要前提，只有增加MSCs歸巢及定植的能力，才能從根本上提高細(xì)胞治療的效率。早期的研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)環(huán)境可影響MSCs所表達(dá)的趨化因子及其受體，這些趨化因子可能促使了MSCs在體內(nèi)的遷移和定植［4］。另外，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)通過靜脈滴注的方式注入體內(nèi)，MSCs會(huì)趨向那些創(chuàng)傷部位，并在靜滴過程中有著修復(fù)創(chuàng)傷和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能［5］。這些研究表明，MSCs的歸巢定植可能與一些細(xì)胞因子有關(guān)。近些年，有關(guān)MSCs遷移運(yùn)動(dòng)的機(jī)制的研究又有新的發(fā)現(xiàn)。

1.1 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)/CXCR4信號(hào)通路 SDF-1即CXCL12，屬于趨化因子家族中的CXC亞族。SDF-1及其受體CXCR4組成的CXCL12/CXCR4軸在干細(xì)胞的募集和遷移中發(fā)揮著重要作用。Kitaori等［6］發(fā)現(xiàn)，SDF-1信號(hào)傳導(dǎo)通路受損會(huì)導(dǎo)致MSCs喪失趨向創(chuàng)傷部位的定向遷移運(yùn)動(dòng)，可見SDF-1(CXCL12)/CXCR4通路在MSCs的趨化遷移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過對(duì)其合成和分泌機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)SDF-1的分泌過程受到連接蛋白-43(Cx43)和連接蛋白-45(Cx45)縫隙連接的調(diào)控，但合成過程和這些連接蛋白并不相關(guān)［7］。隨著基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的興起，一些有利于細(xì)胞歸巢運(yùn)動(dòng)的基因逐漸得到了關(guān)注。相關(guān)研究通過Snail基因轉(zhuǎn)染MSCs的方法提高了細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)，觀察到MSCs的遷移活性得到明顯的增強(qiáng)［8］。同時(shí)，Piva 等［9］發(fā)現(xiàn)一種稱為 Slug 的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子能在轉(zhuǎn)錄過程中控制SDF-1的表達(dá)，能有效增加SDF-1在特定部位表達(dá)補(bǔ)充。SDF-1/CXCR4通路涉及MSCs的存活、遷移和細(xì)胞因子的分泌［10］，是目前此方面研究的熱點(diǎn)。

1.2 晚期糖基化產(chǎn)物(advanced glycation products，AGEs)AGEs是一種內(nèi)源性炎癥調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)MSCs的生理功能。通過相關(guān)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，AGEs能通過激活活性氧-p13通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生諸如CC趨化因子的配體Ccl2、Ccl3、Ccl4和白細(xì)胞介素-Ⅱ這些細(xì)胞因子，進(jìn)而抑制MSCs的生長(zhǎng)和遷移［11］。同時(shí)，AGEs還能促使細(xì)胞端粒酶的衰老(端粒酶為造血細(xì)胞、干細(xì)胞、生殖細(xì)胞所特有，可延長(zhǎng)細(xì)胞端粒，增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力)，從而影響了MSCs的生存遷移能力［12］?？梢姡侠淼乜刂企w內(nèi)的糖代謝，在細(xì)胞治療過程中尤為重要。

1.3 RhoA/Rho激酶信號(hào)通路 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一種對(duì)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生、增殖和分化過程起著重要作用的細(xì)胞因子，廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)，可刺激間充質(zhì)起源細(xì)胞的增殖和分化能力。Xu等［13］研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路可通過與Smad通路相互作用，刺激TGF-β的分泌，有利于MSCs的定植生存。最近還有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs向組織缺氧損傷部位定向遷移的趨化運(yùn)動(dòng)，也與RhoA激酶的活性密切相關(guān)［14］。由此表明，對(duì)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的適當(dāng)干預(yù)可能有利于MSCs在細(xì)胞治療過程中的遷移和有效增殖。

2 MSCs向平滑肌平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells，SMCs)的分化

平滑肌廣泛分布在血管、胃腸道、氣管以及膀胱等處，其功能損害能引起一系列疾病，如動(dòng)脈硬化和膀胱逼尿肌收縮無力等，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。隨著組織工程研究的興起，通過將MSCs向SMCs的分化和補(bǔ)充，有望解決一系列臨床難題。

平滑肌細(xì)胞可分為收縮細(xì)胞和合成細(xì)胞，收縮性平滑肌細(xì)胞表達(dá)著一系列特殊收縮蛋白，合成性平滑肌細(xì)胞則表現(xiàn)出更高的增殖活性，且抑制著這些收縮性蛋白。如何將MSCs誘導(dǎo)分化出平滑肌組織的同時(shí)又保證其收縮功能，是目前亟待解決的問題。在體外培養(yǎng)過程中，以往使用TGF-β或者血栓素A2將BMSCs向平滑肌進(jìn)行誘導(dǎo)分化［15-16］。

MSCs完成歸巢定植后，如何定向分化成為目標(biāo)功能性組織，是細(xì)胞治療的又一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中，MSCs的成平滑肌分化目前仍未提出確切的方案，近些年有關(guān)MSCs定向分化并增殖成為平滑肌細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制研究逐漸成為熱點(diǎn)，又不斷有新的理論提出。

2.1 全反式維甲酸(All-trans retinoic acid，atRA)atRA又稱維A酸，是一種常見的抗腫瘤藥。其也在平滑肌發(fā)育成熟過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可增加肌動(dòng)蛋白、鈣調(diào)蛋白、22ka平滑肌細(xì)胞特殊蛋白和平滑肌肌球蛋白重鏈等收縮性蛋白的表達(dá)，即促進(jìn)平滑肌細(xì)胞收縮表型的形成。在MSCs的定向分化過程中，添加atRA能促進(jìn)分化細(xì)胞的收縮能力，但同時(shí)MSCs的增殖性受到影響［17］。

2.2 TGF-β1和PDGF-BB 平滑肌 α 肌動(dòng)蛋白、鈣調(diào)蛋白和SM-MHC分別是平滑肌分化的早期、中期和后期的標(biāo)記物，常以此檢測(cè)平滑肌的分化程度。早期的研究證實(shí)，TGF-β1在0.1～10 ng/mL的濃度范圍內(nèi)可顯著增加鈣調(diào)蛋白的表達(dá)［18］。最近研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在1～5 ng表現(xiàn)出誘導(dǎo) MSCs向 SMCs分化的能力，在1 ng/mL下表現(xiàn)出最強(qiáng)的誘導(dǎo)能力［19］。人血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF-BB)是一種重要的促有絲分裂因子，時(shí)常用于細(xì)胞培養(yǎng)中，將TGF-β1和PDGF-BB聯(lián)合應(yīng)用，可有效提高M(jìn)SCs的分化增殖效率［20］。

2.3 Myocardin-MicroRNA-1信號(hào)通路 近年來，有研究表明促血管平滑肌細(xì)胞分化因子(myocardin)在誘導(dǎo)SMCs的收縮表型的形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［21］。Myocardin是一種血清應(yīng)答因子共激活物，其過度表達(dá)可誘導(dǎo)MicroRNA-1的表達(dá)，抑制SMCs的增殖能 力［22］。通過 抑 制 myocardin 和MicroRNA-1的表達(dá)水平，進(jìn)而解除了 myocardin-MicroRNA-1信號(hào)通路后，可促進(jìn)平滑肌增殖，更快修復(fù)損傷組織。同時(shí)，在myocardin與Smad 2基因的協(xié)同作用下，myocardin可與 TGF-β聯(lián)合誘導(dǎo)MSCs向平滑肌分化，效率較高［23］。但如何兼顧MSCs的增殖和分化能力，還有待對(duì)于此信號(hào)通路的進(jìn)一步研究。

2.4 膠原蛋白Ⅰ和Ⅳ及非細(xì)胞基質(zhì) 在大多數(shù)研究中，我們通常在培養(yǎng)基中添加TGF-β1和PDGF-BB來完成MSCs向SMCs的誘導(dǎo)分化，近期又有研究將膠原蛋白Ⅰ和Ⅳ及來源膀胱的非細(xì)胞基質(zhì)添加入培養(yǎng)基中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比TGF-β1和PDGF-BB能加強(qiáng)細(xì)胞分化能力，膠原蛋白Ⅰ和Ⅳ及相關(guān)非細(xì)胞基質(zhì)主要作用在于維持MSCs的未分化階段，增強(qiáng)其增殖再生能力，并未表現(xiàn)出誘導(dǎo)分化的趨向［20］。

2.5 多功能性尿激酶受體(urokinasetype plasrinogen activator receptor，uPAR) 已知uPAR能通過激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)控多種組織中細(xì)胞的遷移、附著、增殖和分化。最近，Vallabhaneni等［24］發(fā)現(xiàn)，缺乏uPAR的MSCs表現(xiàn)出趨化遷移和平滑肌組織修復(fù)能力的降低，表明uPAR的表達(dá)水平同MSCs的遷移以及定向分化能力密切相關(guān)。這表示uPAR可能引導(dǎo)MSCs向損傷部位遷移，并調(diào)控著MSCs向功能性SMCs的分化。

2.6 支架材料 MSCs用于平滑肌組織重建往往需要合適的支架材料提供組織生長(zhǎng)需要的環(huán)境。其中，組織工程膀胱用于臨床由來已久，多項(xiàng)研究相繼報(bào)道了MSCs完成了向膀胱SMCs的分化及膀胱組織損傷的修復(fù)和置換［25-26］。配合使用PDGF-BB、TGF-β1和VEGF等細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)成平滑肌分化。在膀胱SMCs的分化過程中，支架的設(shè)計(jì)和材料也有著重要的作用，最近也有了新的發(fā)現(xiàn):①有研究通過將hMSCs種植在聚乙烯1，8-辛二醇-檸檬酸彈性薄膜上，發(fā)現(xiàn)能在體內(nèi)更好地支持部分膀胱組織的再生。1，8-辛二醇-檸檬酸彈性薄膜可順應(yīng)壓力的變化，也適合MSCs貼壁生長(zhǎng)的特性，從而為hMSCs向膀胱組織的再生提供一個(gè)合適的環(huán)境［27］。②還有研究將BMSCs種植在羊膜表面，再將羊膜固定在生物海綿上并移植入大鼠模型中，以此提升BMSCs再生膀胱壁的能力，但結(jié)果顯示此類方法能促進(jìn)膀胱壁再生，但未測(cè)得明顯收縮力，難以保證膀胱功能［28］。此外，膀胱來源的細(xì)胞外基質(zhì)也是重要的支持物質(zhì)，將MSCs和SMCs一同種植入這些基質(zhì)中或許可增加組織重建的效率［29］。

3 結(jié) 語

MSCs作為來源廣泛、分化潛能強(qiáng)大的干細(xì)胞，是目前細(xì)胞治療和組織工程的新興研究熱點(diǎn)。臨床工作中，我們經(jīng)常遇到許多因組織器官損傷而出現(xiàn)功能失代償?shù)募膊?，如關(guān)節(jié)軟骨的損傷、心肌梗死、糖尿病膀胱等，MSCs的深入研究給其帶來治療希望。然而，要將MSCs真正應(yīng)用于臨床，目前還需要解決其歸巢定植和定向分化等一系列問題。MSCs的遷移過程牽涉到了一系列趨化因子和細(xì)胞因子，通過對(duì)相應(yīng)細(xì)胞因子的調(diào)控提高M(jìn)SCs的定植和歸巢運(yùn)動(dòng)，但目前還沒有提出簡(jiǎn)單而有效的解決方法。最近，也不斷有新的理論提出，例如成人外周血、新生兒臍帶血來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞或者臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，可通過MSCs細(xì)胞間的連接及細(xì)胞外調(diào)解激酶，加強(qiáng) MSCs的貼壁能力及 SMCs標(biāo)志基因的表達(dá)［30］。另外，利用MSCs的相關(guān)應(yīng)用研究也取得初步進(jìn)展。Du 等［31］和 Gunetti等［32］將 MSCs應(yīng)用于動(dòng)物壓力性尿失禁治療的研究中，MSCs的成肌分化和療效評(píng)價(jià)肯定了此類細(xì)胞治療的價(jià)值。Chen等［33］在膀胱慢性缺血伴逼尿肌收縮功能障礙的大鼠模型中，注射MSCs配合甲磺酸多沙唑嗪灌胃給藥，使移植的干細(xì)胞在膀胱組織再生，得到了積極的療效。如今，MSCs成平滑肌分化的理論眾多，但尚未有研究提出明確的指導(dǎo)方案。同時(shí)，細(xì)胞治療起步不久，技術(shù)相對(duì)不完善，如何將MSCs運(yùn)用到種子細(xì)胞的培養(yǎng)并有效分化為功能性組織，以及開發(fā)出合適的支架以供植入組織的存活分化，是值得關(guān)注的問題。

目前，大量有關(guān)MSCs的有利基因的過表達(dá)的研究在逐步開展［34-35］，但對(duì)于MSCs成平滑肌分化還存有大量的空白，進(jìn)一步深入研究對(duì)平滑肌功能障礙所引起的疾病的臨床治療將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

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