氣體分子信號(hào)硫化氫和缺血再灌注損傷

馮磊綜述 李文志審校

綜 述

氣體分子信號(hào)硫化氫和缺血再灌注損傷

馮磊綜述 李文志審校

缺血再灌注損傷；炎性反應(yīng)；硫化氫

氣體信號(hào)分子為脂溶性，內(nèi)源產(chǎn)生的氣體信號(hào)分子可以自由通過細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞的內(nèi)部，直接激活細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)，減少膜結(jié)合受體的需要。氣體信號(hào)分子家族包括3個(gè)主要成員：NO、CO、H2S。H2S是最后發(fā)現(xiàn)和描述的氣體信號(hào)分子，其性質(zhì)與其他2個(gè)氣體超家族的成員一樣，在缺血再灌注損傷中的作用逐漸闡明。調(diào)控內(nèi)源性H2S的生成，應(yīng)用外源性H2S在多種器官組織已經(jīng)證明其有細(xì)胞保護(hù)作用。Warenycia等[1]在研究急性H2S中毒的時(shí)候首先報(bào)道了機(jī)體可以產(chǎn)生極低濃度的H2S。Abe 等證明H2S是一種內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，生理濃度的H2S可以提高NMDA受體介導(dǎo)的反應(yīng)，以及在海馬的長(zhǎng)時(shí)程電位起作用。另有報(bào)道一種合成H2S的酶存在于回腸、門靜脈和胸部大血管，因此推測(cè)H2S可能是一種內(nèi)源性的平滑肌松弛劑。

1 H2S的生理作用

在哺乳動(dòng)物組織有3種催化H2S合成的酶：胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和3MST。在多種組織中，主要是CBS和CSE催化生成H2S。最初認(rèn)為腦組織中CBS通過激活Ca2+/鈣調(diào)蛋白通路是產(chǎn)生H2S的主要方式，但研究發(fā)現(xiàn)腦組織內(nèi)90%的H2S是由3MST催化生成的。L-半胱氨酸、α-酮戊二酸和半胱氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在3MST的催化作用下生成H2S[2]。

在生理?xiàng)l件下，2/3的H2S解離為H+和HS-，剩下的1/3以非解離形式存在。體內(nèi)產(chǎn)生的大多數(shù)H2S在線粒體氧化為硫酸。剩下的H2S經(jīng)S-腺苷甲硫氨酸甲基化生成甲硫醇和二甲硫，或者結(jié)合正鐵血紅蛋白形成硫高鐵血紅蛋白。硫酸和硫代硫酸鹽是H2S主要終產(chǎn)物，主要經(jīng)尿液排泄。

2 內(nèi)源性/外源性H2S的細(xì)胞保護(hù)作用

H2S的生理作用使其成為心臟、腦、肝、腎和肺缺血再灌注損傷的保護(hù)劑。近幾年，內(nèi)源性和外源性H2S的細(xì)胞保護(hù)作用在體內(nèi)和體外缺血性損傷的模型中得到證實(shí)[3]。內(nèi)源性H2S的作用最初應(yīng)用藥理學(xué)抑制劑CGL研究，而研究外源性H2S的作用是通過應(yīng)用NaHS、Na2S或者吸入H2S氣體[4]。

2.1 H2S與心肌缺血再灌注 一系列研究證明H2S在心肌缺血再灌注損傷中具有細(xì)胞保護(hù)作用[5，6]。Johansen研究H2S在心肌缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用，在灌注前10min，維持至再灌注后10min持續(xù)給予NaHS(1μmol/L)，觀察到梗死面積減小接近20%。Bian等[7]研究離體心臟在局部缺血情況下內(nèi)源性產(chǎn)生的H2S和外源性應(yīng)用NaHS對(duì)心臟節(jié)律的影響，發(fā)現(xiàn)給予NaHS治療組由缺血再灌注引起的心律失常的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重性會(huì)顯著減輕。Bliksoen證明在心臟缺血再灌損傷中，應(yīng)用H2S缺血預(yù)處理，涉及了H2S參與的蛋白激酶磷酸化，梗死面積顯著減少，說明內(nèi)源性H2S在心肌缺血再灌注損傷起到關(guān)鍵作用。內(nèi)源性和外源性H2S的心臟保護(hù)作用都得到了證實(shí)。Sivarajah等[8]首先證實(shí)在心肌損傷中內(nèi)源性H2S有細(xì)胞保護(hù)作用，增加內(nèi)源性H2S的生成與外源性應(yīng)用H2S具有相似的細(xì)胞保護(hù)作用。抑制內(nèi)源性H2S的生成可以引起高血壓和減少內(nèi)皮依賴性血管舒張，同樣小鼠的心肌缺血再灌注損傷會(huì)加重[9]。體內(nèi)和體外的研究表明內(nèi)源性和外源性H2S有心肌細(xì)胞保護(hù)作用，H2S對(duì)心血管疾病可能有治療作用。

2.2 H2S與腦缺血再灌注 已有研究表明缺血再灌注損傷引起的氧化應(yīng)激主要損傷神經(jīng)細(xì)胞。體外研究H2S對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用，采用的谷氨酸鹽和NaHS，結(jié)果表明NaHS可以防止神經(jīng)細(xì)胞的谷氨酸鹽毒性作用。Kimura等[10]證明H2S的神經(jīng)細(xì)胞抗氧化作用不是本身的功能，而是增加了具有強(qiáng)抗氧化作用的谷胱甘肽的生成。然而更多的研究表明體內(nèi)極低濃度的H2S具有保護(hù)作用。Florian研究大鼠在全腦缺血期間吸入H2S氣體，使大鼠腦內(nèi)H2S的濃度從(1.12±4.6) μg/g增加到(2.70±5.3) μg/g，可以使梗死面積減少50%。 Minamishima等[11]采用鼠科動(dòng)物心臟驟停/心肺復(fù)蘇的模型來研究H2S(Na2S, 0.55 mg/kg)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。在大鼠心肺復(fù)蘇前1min經(jīng)股靜脈給予Na2S，觀察到其可以改善神經(jīng)功能，減少海馬區(qū)活化的凋亡蛋白Caspase-3，增加大腦皮質(zhì)磷酸化的抗凋亡蛋白GSK-3β。

以上研究揭示了H2S多樣的神經(jīng)保護(hù)作用。體內(nèi)和體外研究表明低濃度的H2S在腦內(nèi)參與氧化應(yīng)激反應(yīng)。然而，高濃度的H2S在急性腦卒中模型中既有加重腦損傷作用，也有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

2.3 H2S與肝臟缺血再灌注 H2S的細(xì)胞保護(hù)作用也涉及肝臟。Jha[12]證明在小鼠肝臟經(jīng)歷60min缺血，5 h再灌注，H2S具有肝細(xì)胞保護(hù)作用。在再灌注前5 min檢測(cè)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，此時(shí)這2種酶顯著升高。經(jīng)Na2S治療后，AST下降71%，ALT下降69%，證明了H2S可以減輕肝臟缺血再灌注損傷。H2S的肝細(xì)胞保護(hù)作用是通過降低脂質(zhì)過氧化，增加抗氧化信號(hào)，增加抗凋亡信號(hào)的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

2.4 H2S與腎缺血再灌注 Tripatara研究?jī)?nèi)源性與外源性H2S在腎臟缺血再灌注損傷中的作用。在缺血前1h給予CSE的抑制劑 PAG，發(fā)現(xiàn)大鼠血漿肌酸水平升高，腎功能下降。在實(shí)行雙側(cè)腎動(dòng)脈結(jié)扎的大鼠，在缺血前15 min給予NaHS，觀察到腎功能顯著提高，這說明H2S在腎臟缺血損傷中起到關(guān)鍵作用。Xu等[3]發(fā)現(xiàn)腎臟經(jīng)歷45 min缺血，6 h再灌注會(huì)影響H2S和肌酸的濃度，在大鼠腎臟缺血過程，會(huì)觀察到H2S的濃度顯著下降，血漿肌酸水平顯著上升。證明在腎臟缺血再灌注過程中腎臟損傷來源于CBS活性降低。H2S能改善腎功能障礙相關(guān)的缺血損傷，改善腎臟供血，增高肌酐清除率，減輕氧化損傷[13]。

2.5 H2S與肺缺血再灌注 Fu等發(fā)現(xiàn)H2S可以作為一種肺保護(hù)藥物。他們發(fā)現(xiàn)在大鼠肺缺血再灌注損傷中，肺缺血引起CSE的活性增加46%，引起H2S的濃度增加54%。他們?cè)诜稳毖? min用H2S氣體(50μmol/L,100μmol/L)灌注大鼠肺組織，在肺組織形態(tài)學(xué)方面，經(jīng)過H2S預(yù)處理的肺組織肺功能得到明顯的改善。H2S也可以改善缺血再灌注過程中肺組織的組織學(xué)改變，改善肺的通氣速率，降低肺的干濕比，改善肺組織順應(yīng)性。丙二醛常用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)氧化水平，他們發(fā)現(xiàn)H2S能顯著降低細(xì)胞內(nèi)丙二醛的水平，說明H2S可以減輕肺的氧化應(yīng)激損傷。

2.6 H2S與腸缺血再灌注 在體外培養(yǎng)的大鼠腸細(xì)胞分別缺氧1h、2h或3h，均復(fù)氧3h，均在缺氧(或缺血)前20min給予NaHS，發(fā)現(xiàn)H2S(10μmol/L)可使缺氧1h的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減低；缺氧3h后給予1μmol/L、10μmol/L和 100μmol/L H2S同樣可使細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低。在大鼠體內(nèi)H2S(10μmol/L或100μmol/L)可使I/R(1h/3h)的腸保持正常的顏色、絨毛形態(tài)，缺血2h再灌注3h后，只有10μmol/L H2S處理的腸沒有損傷，上述研究表明H2S可明顯減輕腸的I/R損傷[14，15]。

2.7 H2S與肌肉缺血再灌注 在培養(yǎng)的小鼠骨骼肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型中，發(fā)現(xiàn)給予10μmol/L H2S其保護(hù)作用明顯。在小鼠下肢骨骼肌I/R(3h/3h)模型中，10μmol/L H2S可明顯減輕I/R所致的細(xì)胞損傷，降低凋亡指數(shù)[16]。

3 H2S的作用機(jī)制

3.1 KATP Bian等[7]對(duì)離體心肌細(xì)胞I/R(9 min/10min)研究表明，在缺血前間斷3次給予NaHS(100μmol/L,每次3min)可明顯減輕I/R損傷作用，細(xì)胞活力增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度降低，給予膜KATP特異性抑制劑HMR-1098和非選擇性KATP抑制劑格列苯脲均使NaHS對(duì)大鼠心肌I/R的保護(hù)作用消失，而給予線粒體KATP通道抑制劑(5-HD，100μmol/L)無上述作用，說明膜KATP在H2S減輕心肌I/R中發(fā)揮著重要作用。

以上研究表明，H2S在許多器官系統(tǒng)有保護(hù)作用。研究H2S在這些器官系統(tǒng)的作用機(jī)制很重要。在神經(jīng)系統(tǒng)，H2S作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)，通過誘導(dǎo)cAMP生成來調(diào)節(jié)NMDA受體，作為過氧化硝基的抑制劑。在心血管系統(tǒng)，已經(jīng)證明H2S有許多生理作用：血管舒張劑，通過開放KATP發(fā)揮抗凋亡作用[17]，通過氧化磷酸化Akt發(fā)揮降壓作用，調(diào)節(jié)白細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，上調(diào)抗炎信號(hào)，通過保護(hù)線粒體功能發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

3.2 H2S和凋亡 H2S的心臟保護(hù)作用的機(jī)制不只局限于調(diào)節(jié)KATP和鈣超載。有許多證據(jù)表明H2S在心肌缺血再灌注中還有抗凋亡作用。激活的2個(gè)重要細(xì)胞存活通路，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)通路(ERK1/2)/絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3-kinase)，他們與PKCε相互作用或者分別抑制Bad和Caspase-9，鈍化促凋亡通路。Elrod等[18]用成熟的離體肌細(xì)胞，經(jīng)歷6 h缺氧，12h再灌注，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過NaHS治療的肌細(xì)胞會(huì)減少Caspase-3的激活，同樣會(huì)減少片段樣的DNA產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)表明在心肌缺血再灌注后H2S會(huì)抑制凋亡的級(jí)聯(lián)。另外，Sivarajah等證明大鼠心臟局部缺血再灌注會(huì)增加心臟磷酸化的p38、MAPK、JNK1/2以及促凋亡蛋白，但是在缺血前15 min給予NaHS會(huì)顯著減少磷酸化的 p38、MAPK和JNK1/2。另一種促凋亡蛋白、細(xì)胞色素C是電子傳遞鏈的基本成分，一旦受到促凋亡的刺激，會(huì)把電子從線粒體傳遞到細(xì)胞質(zhì)。它會(huì)激活另一種凋亡蛋白，包括凋亡的活化劑Caspase-3。經(jīng)過 Na2S治療的小鼠會(huì)增加未活化的Caspase-3，減少活化的Caspase-3，減少線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)。因此， Na2S在心肌缺血再灌注中保護(hù)心臟組織、防止凋亡信號(hào)的激活。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活通路(STAT)在心肌梗死中參與重要的心肌反應(yīng)，高表達(dá)STAT-3亞型，表現(xiàn)出心臟保護(hù)作用。抑制STAT-3亞型會(huì)增加Caspase-3在心臟中的表達(dá)，因此會(huì)加重缺血再灌注損傷[19]。Calvert等[5]證明在體內(nèi)H2S通過磷酸化PKCε和STAT-3，抑制了促凋亡因子Bad、上調(diào)了促存活因子Bcl-2和Bax-xL、上調(diào)熱休克蛋白。因此，證明H2S在心肌缺血再灌注損傷中有抗凋亡作用。

3.3 H2S與保護(hù)線粒體 一個(gè)細(xì)胞的生存能力依靠線粒體的功能。缺血再灌注期間，線粒體經(jīng)歷氧剝奪、活性氧族產(chǎn)生過剩、線粒體膜超極化。Roth等證明高濃度的H2S在小鼠體內(nèi)可以引起體溫過低，通過抑制細(xì)胞色素C氧化酶，導(dǎo)致代謝率下降和核心溫度降低。Elrod在體外模型利用Na2S治療來評(píng)價(jià)H2S介導(dǎo)的線粒體保護(hù)的可能機(jī)制，他們利用離體的線粒體，缺氧30min后，用Na2S (10μmol/L)治療后，缺氧后呼吸速率有很好的恢復(fù)。小鼠在再灌注期間給予Na2S治療，也會(huì)減少線粒體腫脹，增加線粒體基質(zhì)密度。

3.4 H2S和炎性反應(yīng) 炎性反應(yīng)是缺血再灌注損傷早期的主要組成。發(fā)現(xiàn)H2S的供體可以顯著降低血漿內(nèi)促炎介質(zhì)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，同時(shí)會(huì)增加抗炎介質(zhì)白細(xì)胞介素-10(IL-10)，其他的研究也表明這些機(jī)制可能參與H2S的抗炎反應(yīng)。缺血再灌注后，早期的炎性反應(yīng)使白細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞。Zanardo等[20]證明H2S是一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素與內(nèi)皮的相互作用。在白細(xì)胞黏附前30min給予Na2S (1～100μmol/kg) 或者NaHS (100μmol/kg)，觀察到應(yīng)用H2S治療大鼠會(huì)減少白細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞，并且呈劑量依賴性。許多機(jī)制研究H2S在缺血再灌注后保護(hù)組織防止炎性損傷。H2S作為一個(gè)炎性調(diào)節(jié)器的作用越來越得到認(rèn)可。

4 小結(jié)

無論是內(nèi)源性還是外源性的H2S，其在身體各處缺血再灌注損傷中都有保護(hù)功能。其中涉及的機(jī)制包括：通過開放 KATP通道控制細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度、激活抗凋亡通絡(luò)(ERK1/2/MAPK、PI-3kinase/Akt, JAK-STAT)、通過保持線粒體膜電位和抑制mPTP 開放來保護(hù)線粒體功能、通過激活eNOS和 p38MAPK發(fā)揮抗炎作用。自從發(fā)現(xiàn)了H2S的細(xì)胞保護(hù)作用，上調(diào)內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生或者提供生成H2S的有效供體成為科學(xué)家和臨床醫(yī)師的焦點(diǎn)。雖然H2S在缺血再灌注損傷中有治療作用，潛在的問題是傳統(tǒng)的H2S供體如NaHS和Na2S，作用時(shí)間短，不能連續(xù)釋放H2S[21～23]。

雖然H2S的生理作用和細(xì)胞保護(hù)作用已經(jīng)得到證實(shí)，但其中涉及的機(jī)制還沒有完全了解。在過去的20年中，H2S已經(jīng)從一個(gè)毒性氣體變成了一個(gè)有治療缺血再灌注潛在作用的治療藥物。最近的研究揭示了在多種組織的缺血性損傷中，H2S有許多有益作用。例如，在缺血前或者缺血時(shí)，內(nèi)源性或者外源性應(yīng)用H2S都有心肌細(xì)胞保護(hù)作用、H2S引起的體溫過低可以起到神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用、通過減少脂質(zhì)過氧化和增加抗氧化、抗凋亡信號(hào)起到肝細(xì)胞保護(hù)作用、通過激活 CBS起到腎臟保護(hù)作用、通過激活 CSE防止肺缺血性損傷。盡管關(guān)于H2S在不同器官的生理作用的研究有許多進(jìn)展，但仍有很大的研究空間。

1 Warenycia MW,Goodwin LR,Francom DM,et al.Dithiothreitol liberates non-acid sulfide from brain tissue of H2S-poisoned animals[J].Arch Toxicol,1990,64(8):650-655.

2 Shibuya N, Tanaka M, Yoshida M, et al. 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase produces hydrogen sulfide and bound sulfane sulfur in the brain[J]. Antioxid Redox Signal，2009，11(4):703-714.

3 Xu Z, Prathapasinghe G, Wu N, et al. Ischemia-reperfusion reduces cystathionine-beta-synthase-mediated hydrogen sulfide generation in the kidney[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2009，297(1):F27-35.

4 康凱，姜洪池.氣體信號(hào)分子硫化氫與疾病[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2009，16(2)：170-173.

5 Calvert JW, Jha S, Gundewar S, et al. Hydrogen sulfide mediates cardioprotection through nrf2signaling[J]. Circ Res，2009，105(4):365-374.

6 Osipov RM, Robich MP, Feng J, et al. Effect of hydrogen sulfide in a porcine model of myocardial ischemia-reperfusion:comparison of different administration regimens and characterization of the cellular mechanisms of protection[J]. J Cardiovasc Pharmacol，2009，54(4):287-297.

7 Bian J S，Yong Q c，Pan TT，et a1．Role of hydrogen sulfide in the cardioprotection caused by ischemic preconditioning in the rat heart and cardiac myocytes[J]．J Pharmacol Exp Ther，2006，316(2)：670-678．

8 Sivarajah A, Collino M, Yasin M, et al. Anti apoptotic and anti-inflammatory effects of hydrogen sulfide in a rat model of regional myocardial i/r[J]. Shock，2009，31(3):267-274.

9 Calvert JW, Coetzee WA, Lefer DJ. Novel insights into hydrogen sulfide mediated cytoprotection[J].Antioxid Redox Signal，2009，94(7)：805-814.

10 Kimura Y, Goto Y, Kimura H. Hydrogen sulfide increases glutathione production and suppresses oxidative stress in mitochondria[J]. Antioxid Redox Signal，2010，12(1):1-13.

11 Minamishima S, Bougaki M, Sips PY, et al.Hydrogen sulfide improves survival after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation via a nitric oxide synthase 3-dependent mechanism in mice[J].Circulation，2009，120(10):888-896.

12 Jha S, Calvert JW, Duranski MR, et al. Hydrogen sulfide attenuates hepatic ischemia-reperfusion injury: role of antioxidant and antiapoptotic signaling[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，295(2):H801-806.

13 Ganster F，Burban M，de La Bourdonnaye M，et a1．Effects of hydrogen sulfide on hemodynamics，inflammatory response and oxidative stress during resuscitated hemorrhagic shock in rats[J]．Crit Care，2010，14(5)：R165.

14 Henderson PW，Weinstein AL，Sung J，et a1．Hydrogen sulfide attenuates ischemia-reperfusion injury in in vitro and in vivo models of intestine free tissue transfer[J]．Plast Re constr Surg，2011，127(1)：487-488．

15 王新寶.氣體信號(hào)分子硫化氫與缺血再灌注損傷[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,33(1)：131-135.

16 Henderson P W，Singh S P，Weinstein A L，et a1．Therapeutic metabolic inhibition：hydrogen sulfide significantly mitigates skeletal muscle isehemia reperfusion injury in vitro and in vivo[J]．Plast Reconstr surg，2010，126(6)：1890-1898．

17 Yusof M, Kamada K, Kalogeris T, et al.Hydrogen sulfide triggers late-phase preconditioning in postischemic small intestine by an no- and p38mapk-dependent mechanism[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(3):H868-876.

18 Elrod JW, Calvert JW, Morrison J, et al. Hydrogen sulfide attenuates myocardial ischemia reperfusion injury by preservation of mitochondrial function[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:15560-15565.

19 Wang M, Wang Y, Abarbanell A, et al. Both endogenous and exogenous testosterone decrease myocardial stat3activation and socs3expression after acute ischemia and reperfusion[J]. Surgery，2009，146(2):138-144.

20 Zanardo RC, Brancaleone V, Distrutti E, et al. Hydro-gen sulfide is an endogenous modulator of leukocyte-mediated inflammation[J].FASEB J，2006，20:2118-2120.

21 Florian B, Vintilescu R, Balseanu AT, et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia[J].Neurosci Lett，2008，438(2):180-185.

22 Tyagi N, Moshal KS, Sen U, et al. H2S protects against methionine-induced oxidative stress in brain endothelial cells[J].Antioxid Redox Signal，2009，11(1):25-33.

23 Linden DR, Levitt MD, Farrugia G, et al.Endogenous production of H2S in the gastrointestinal tract: still in search of a physiologic function[J].Antioxid Redox Signal，2010，12(9):1135-1146.

150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院麻醉科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.03.039

2013-07-18)