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    人樹(shù)突狀細(xì)胞與肺癌細(xì)胞A-549融合疫苗生物學(xué) 特性研究

    2014-08-10 12:28:27王佳烈馬國(guó)強(qiáng)
    疑難病雜志 2014年3期
    關(guān)鍵詞:百分率抗原干細(xì)胞

    王佳烈,馬國(guó)強(qiáng)

    論著·基礎(chǔ)

    人樹(shù)突狀細(xì)胞與肺癌細(xì)胞A-549融合疫苗生物學(xué) 特性研究

    王佳烈,馬國(guó)強(qiáng)

    目的探討人樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)與人肺癌細(xì)胞A-549融合所得疫苗在制備過(guò)程中的生物學(xué)特性,總結(jié)高效制備融合疫苗的方法。方法應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化的方法制備肺癌患者人外周血單核細(xì)胞以獲得DC,尋找DC制備率最高時(shí)間段;同時(shí)應(yīng)用PKH672GL(綠色熒光)和PKH262GL(紅熒光)分別標(biāo)記DC和肺癌細(xì)胞A-549細(xì)胞,篩查最佳的融合比例。結(jié)果應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化法進(jìn)行DC制備第7天所得百分率為(66.26±5.13)%,高于其他時(shí)間(P<0.05);通過(guò)對(duì)比不同融合比例DC與人肺癌細(xì)胞A-549,顯示1∶1時(shí)所取得的融合百分率為(35.15±2.16)%,高于其他比例(P<0.05)。結(jié)論在DC制備過(guò)程中制備第7天所得DC百分率最高,應(yīng)選取此時(shí)作為提取DC的最佳時(shí)間;同時(shí)DC與人肺癌細(xì)胞A-549以1∶1比例相融合所得疫苗百分率最高。

    人樹(shù)突狀細(xì)胞;人肺癌細(xì)胞A-549;融合;疫苗

    肺癌是十分常見(jiàn)的一種惡性腫瘤,目前的治療方法主要有放療、化療及手術(shù)等多種方式,但治療效果仍不十分理想。細(xì)胞免疫治療是近年來(lái)新興的一種腫瘤治療方式。其主要原理為誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)和自體T細(xì)胞,使其成為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。其中DC作為一種遞呈細(xì)胞,不僅能夠加工和遞呈抗原,還能有效激活T淋巴細(xì)胞使其成為效應(yīng)T細(xì)胞,因此DC在免疫治療中有著十分重要的作用[1]?,F(xiàn)制備人外周血單核細(xì)胞獲得DC以找出其制備的最佳時(shí)段,并通過(guò)標(biāo)記DC與人肺癌細(xì)胞A-549,找出二者的最佳融合比。

    1 材料與方法

    1.1 材料 應(yīng)用15%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)50例人肺癌細(xì)胞A-549,納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)過(guò)臨床診斷、影像學(xué)診斷和病理診斷均確診為肺癌患者;尚未進(jìn)行放療、化療或手術(shù)治療;患者生存時(shí)間保守估計(jì)﹥6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn):存在嚴(yán)重軀體性疾?。怀霈F(xiàn)腦轉(zhuǎn)移;自身或家族內(nèi)存在精神病病史;存在嚴(yán)重智力或認(rèn)知障礙。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組,每組10例;同時(shí)應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化法培養(yǎng)250份DC,將250份DC同樣按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組,每組50份,培養(yǎng)時(shí)間分別為1d、3d、7 d、10d及14 d。

    1.2 方法

    1.2.1 培養(yǎng)方法:將含有15% FCS的RPMI1640培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株A-549細(xì)胞,用GM-CSF和IL-4優(yōu)化的方法,培養(yǎng)成人外周血單核細(xì)胞,并用TNF-α和PGE2促成熟2d后獲得成熟DC,倒置顯微鏡觀察DC的形態(tài)[2]。

    1.2.2 檢測(cè)方法:分別選取A549細(xì)胞和細(xì)胞球置于蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng),給予其37℃和5% CO2,完成爬片后取出玻片使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定,之后使用PBS進(jìn)行潤(rùn)洗,接著用0.3%Triton X-100進(jìn)行透化處理,封閉后以1∶400的比例加入一抗,并置于4℃的冰箱內(nèi)過(guò)夜[3]。第2天,取出玻片,使用PBS洗滌后以1∶500的比例加入二抗,同時(shí)以37℃的溫度在避光條件下孵育1h,再用PBS洗滌,應(yīng)用PKH672GL(綠色熒光)和PKH262GL(紅熒光)分別標(biāo)記DC和肺癌細(xì)胞A-549細(xì)胞。以50%聚乙二醇和10%二甲基亞砜作為融合劑,構(gòu)建融合細(xì)胞,用共聚焦顯微鏡對(duì)融合細(xì)胞照相,并使用流式細(xì)胞儀快速檢測(cè)紅綠雙熒光細(xì)胞所占的百分率代表細(xì)胞融合率[4]。

    1.3 觀察項(xiàng)目

    1.3.1 DC制備最佳時(shí)間:應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化的方法對(duì)人外周血單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),分別于第1天、第3天、第7天、第10天及第14天各培養(yǎng)皿加入MCH-I類分子,在充分震蕩后應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),對(duì)比分析不同時(shí)間DC的制備率。

    1.3.2 最佳融合比例:于DC制備最佳時(shí)間采集DC,應(yīng)用PKH672GL染色標(biāo)記,同時(shí)將染色標(biāo)記好的DC與應(yīng)用PKH262GL染色標(biāo)記好的人肺癌細(xì)胞A-549進(jìn)行融合,以二甲基亞砜作為融合劑,應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)融合百分率進(jìn)行分析,對(duì)比分析不同DC與人肺癌細(xì)胞A-549所融合的比例(包括3∶1、2∶1、1∶1、1∶2及1∶3)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用F檢驗(yàn)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 DC制備率最佳時(shí)間 應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化法進(jìn)行DC制備第1天、第3天、第7天、第10天、第14天制備率分別為(35.51±3.11)%、(46.26±2.7)%、(66.26±5.13)%、(51.18±2.82)%、(41.51±1.38%)。第7天所得百分率高于其他時(shí)間(P<0.05)。

    2.2 最佳融合比例 通過(guò)對(duì)比不同融合比例DC與人肺癌細(xì)胞A-549顯示,3∶1、2∶1、1∶2、1∶3、時(shí)融合率分別為(13.62±1.71)%、(21.16±2.61)%、(35.15±2.16)%、(11.78±1.53)%、(30.13±1.93)%。1∶1時(shí)所取得的融合百分率高于其他比例(P<0.05)。

    3 討 論

    DC是目前所發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞之一,其在刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)中有著十分重要的作用。DC能表達(dá)高水平的MHC-I、MHC-II類分子及CD80和 CD40等分子,能有效地向T淋巴細(xì)胞遞呈抗原刺激T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。腫瘤患者體內(nèi)由于缺少DC或存在功能障礙,導(dǎo)致無(wú)法有效遞呈腫瘤抗原,T細(xì)胞免疫激活受阻,致使機(jī)體免疫功能下降甚至消失或是出現(xiàn)免疫耐受,使得腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)。人體內(nèi)DC主要源于骨髓、外周血及臍血。而單核DC與具有抗原性的單核腫瘤細(xì)胞融合就可以產(chǎn)生特異性較強(qiáng)的免疫性抗原。因此尋找誘導(dǎo)癌細(xì)胞增值分化以及致使治療失敗的主要成分就成為了研究的關(guān)鍵。

    本研究中,為了防止沒(méi)有經(jīng)過(guò)融合的腫瘤細(xì)胞對(duì)患者產(chǎn)生污染,需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選,以便濾出未融合腫瘤細(xì)胞,提高融合DC疫苗的純度。為達(dá)到這個(gè)目的,本次研究使用特異性標(biāo)記體或是帶有特異性標(biāo)志的腫瘤細(xì)胞,通過(guò)在極低濃度條件下使用PKH67GL和PKH26GL標(biāo)記人DC和肺細(xì)胞,這樣就能保證在正常濃度范圍內(nèi)細(xì)胞不會(huì)存在明顯毒性[6]。通過(guò)在共聚焦顯微鏡視野下觀察呈現(xiàn)出紅色和綠色2種熒光的細(xì)胞融合,能夠利于細(xì)胞儀進(jìn)行篩選。使用PKH67-GL和PKH-62GL熒光染料標(biāo)記細(xì)胞,能夠使人源DC與肺部細(xì)胞結(jié)合的DC疫苗更加易于區(qū)分,這種方式不僅簡(jiǎn)便,而且觀察起來(lái)十分直觀、快速,不需要考慮腫瘤細(xì)胞的抗原標(biāo)志就可以方便快捷地篩選融合細(xì)胞?;谶@些特性,其在融合DC疫苗治療肺癌領(lǐng)域內(nèi)得到普遍重視。此次研究使用了一種更加可靠、有效的分離方式來(lái)分離肺癌干細(xì)胞,即在無(wú)血清的條件下通過(guò)使用培養(yǎng)懸浮球的方式來(lái)分離肺癌干細(xì)胞。在這種方法中,向無(wú)血清條件培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)因子,能夠達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞繁殖的同時(shí)保持細(xì)胞未分化狀態(tài)的目的。在這類培養(yǎng)基中,只有腫瘤干細(xì)胞能夠不斷生長(zhǎng),因此在這個(gè)分離過(guò)程中,能夠大量富集腫瘤干細(xì)胞[7]。這說(shuō)明懸浮球培養(yǎng)的方式能夠有效分離和富集肺癌干細(xì)胞,使得肺癌干細(xì)胞能夠具有更強(qiáng)的更新和繁殖能力,已達(dá)到標(biāo)記肺癌干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。單核腫瘤干細(xì)胞與DC經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合就可以產(chǎn)生特異性抗原。

    聚乙二醇是最常用的誘導(dǎo)融合劑,其誘導(dǎo)細(xì)胞融合機(jī)制是作用于細(xì)胞膜,相鄰2個(gè)細(xì)胞的胞膜連接部穿通,胞膜融合形成異型核細(xì)胞進(jìn)而通過(guò)有絲分裂將核合二為一,產(chǎn)生雜交子代細(xì)胞。聚乙二醇法融合人外周血DC和人肺癌細(xì)胞株A-549或H-446所獲得的雜交瘤細(xì)胞,既可內(nèi)源性表達(dá)腫瘤抗原,又具DC抗原遞呈能力, 有效地改善腫瘤細(xì)胞上共刺激分子的表達(dá),誘導(dǎo)特異抗腫瘤細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)[8]。本組通過(guò)運(yùn)用PKH672GL(綠色熒光)和PKH262GL(紅熒光)分別標(biāo)記DC和肺癌細(xì)胞A-549細(xì)胞,并采用聚乙二醇作為誘導(dǎo)融合劑,結(jié)果顯示:應(yīng)用GM-CSF和IL-4優(yōu)化法進(jìn)行DC制備第7天所得百分率高于其他時(shí)間(P<0.05);通過(guò)對(duì)比不同融合比例DC與人肺癌細(xì)胞A-549顯示,1∶1時(shí)所取得的融合百分率高于其他比例(P<0.05)。因此在制備DC與人肺癌細(xì)胞A-549聯(lián)合疫苗時(shí)應(yīng)選取DC制備的第7天且選取DC與人肺癌細(xì)胞A-549為1∶1。

    1 Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CA Cancer J Clin,2011,61(4):212-236.

    2 Zhang Q,Shi S,Yen Y,et al.A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy[J].Cancer Lett,2010,289(2):151-160.

    3 Teng Y,Wang X,Wang Y,et al.Wnt/beta-catenin signaling regulates cancer stem cells in lung cancer A549 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,392(3):373-379.

    5 Yang L,Ping YF,Yu X,et al.Gastric cancer stem-like cells possess higher capability of invasion and metastasis in association with a mesenchymal transition phenotype[J].Cancer Lett,2011,310(1):46-52.

    6 Xiang R,Liao D,Cheng T,et al.Downregulation of transcriiption factor SOX2in cancer stem cells suppresses growth and metastasis of lung cancer[J].Br J Cancer,2011,104(9):1410-1417.

    7 Wang J,Shi G,Zhang S,et al.Clinical value of serum TPS,CEA,Pro-GRP and CYFRA21-1in patients with lung cancer[J].Chinese Journal of Lung Cancer,2010,13(5):500-505.

    有效數(shù)字的確定

    VaccineresearchonbiologicalcharacteristicsofhumandendriticcellsandA-549lungcancercellfusion

    WANGJialie,MAGuoqiang.

    DepartmentofRespiration,theInnerMongoliaAutonomousRegionPeople'sHospital,Hohhot010017,ChinaCorrespondingauthor:MAGuoqiang,E-mail:813812024@qq.com

    ObjectiveTo explore the human dendritic cells (DC) and A-549 in human lung cancer cell fusion vaccine in the biological characteristics of the process of preparation, summarize the methods of efficient preparation of fusion vaccine.MethodsBy using of GM-CSF and IL-4 optimization method for preparing patients with lung cancer in human peripheral blood mononuclear cells for DC, DC looking for the highest rate of preparation time; while applying PKH672GL (green fluorescence) and PKH262GL (red fluorescence) and lung cancer cells were labeled DC and A-549 cells, screening the best blend ratio.ResultsApplication of GM-CSF and IL-4 optimization method for the first 7 days resulting percentage was (66.26±5.13)%, higher than at other times (P<0.05) DC preparation; By comparing different fusion the proportion of DC with human lung cancer cell A-549, showing the percentage of fusion was obtained (35.15±2.16)%, higher than the other ratios (P<0.05).ConclusionThe seventh days' percentage of DC is the best in the preparation process of DC, should be selected as optimum extraction time DC; while DC and human lung cancer cell line A-549 with a ratio of 1∶1shows the highest percentage combined vaccine.

    Human dendritic cells; Human lung cancer cell A-549; Fusion; Vaccine

    內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金資助(No.2011MS1179)

    010017 呼和浩特,內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科

    馬國(guó)強(qiáng),E-mail:813812024@qq.com

    10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.03.027

    2013-11-21)

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