α－常春藤皂苷丙烯酸樹脂L100－55納米粒的制備及體外評(píng)價(jià)

李 穎，尹紅然，耿麗娟，游本剛

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇蘇州215123；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇蘇州215104）

·制劑研究·

α－常春藤皂苷丙烯酸樹脂L100－55納米粒的制備及體外評(píng)價(jià)

李 穎1，2，尹紅然1，耿麗娟1，游本剛1

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇蘇州215123；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇蘇州215104）

目的采用腸溶材料丙烯酸樹脂L100－55作為載體材料，制備α－常春藤皂苷丙烯酸樹脂納米粒（SPD－L100－55－NPs）并進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。方法采用改良乳化溶劑擴(kuò)散法制備SPD－L100－55－NPs，以粒徑、包封率（EE）和多分散指數(shù)（P.I.）為綜合指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化納米粒的處方工藝，以紅外光譜（FT－IR）、X射線衍射（XRD）、差示掃描量熱分析（DSC）等對(duì)制備的納米粒進(jìn)行評(píng)價(jià)，并考察其體外釋放特性。結(jié)果制得的SPD－L100－55－NPs納米粒外觀圓整、分布均勻，平均粒徑為（63.5±3.6）nm，包封率為98.91%± 0.18%，P.I.為0.198±0.014。藥物在納米粒中被載體材料有效包裹，體外釋放具有緩釋特性和pH依賴性。結(jié)論所制得的納米粒圓整均勻、包封率高，在體外具有良好的緩釋特性和pH敏感性。

α－常春藤皂苷；丙烯酸樹脂（L100－55）；納米粒；釋放

α－常春藤皂苷［1］（saponins PD，SPD）是從中藥預(yù)知子［2］中提取的三萜皂苷類化合物，具有保肝護(hù)肝［3～6］、抗腫瘤［7］等多種藥理活性，但SPD難溶于水，口服吸收差，體內(nèi)生物利用度較低，且對(duì)黏膜有較強(qiáng)的刺激性。丙烯酸樹脂具有安全、無毒，理化性能穩(wěn)定，不被吸收和代謝等優(yōu)點(diǎn)，在降低藥物毒副作用，提高生物利用度和療效等方面具有重要意義［8］。本研究以腸溶材料丙烯酸樹脂Eudragit L100－55為載體材料，制備α－常春藤皂苷丙烯酸樹脂L100－55納米粒，以期降低藥物毒副作用并提高其生物利用度。

1 材料與儀器

1.1 材料 α－常春藤皂苷（自制，純度90%以上）；α－常春藤皂苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111880－201001）；丙烯酸樹脂L100－55（德國(guó)羅姆公司）；泊洛沙姆F68（深圳市優(yōu)普惠實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；乙腈為色譜純，甲醇等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 納米粒度和Zeta電位分析儀（NICOMP 380ZLS，Santa Barbara，USA）；LC－15C高效液相色譜儀（日本島津公司）；HPP－5001激光粒度分析儀（英國(guó)Malvern公司）；Optima max超速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；真空冷凍干燥機(jī)（Lg－5A，上海離心機(jī)械研究所）；H600透射電子顯微鏡（日立公司，日本）；X′Pert－Pro MPD X射線多晶衍射儀（荷蘭帕納科公司）；SDT 2960熱分析儀（美國(guó)TA Instruments公司）；MagnaIR550型紅外光譜儀（美國(guó)Nicolet公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 SPD的含量測(cè)定

2.1.1 HPLC色譜條件 色譜柱：Cosmosil C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－水－磷酸（42∶58∶0.1）；流速：1 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取SPD對(duì)照品10.04 mg，于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成濃度100.40μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

分別精密量取SPD貯備液配制成濃度0.502、5.02、10.04、20.08、40.16、80.32μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件，取20μL進(jìn)樣，記錄藥物峰面積。以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得線性方程為：A＝6 533.2C－1 201.9，r＝0.999 9（n＝5），在0.502～80.32μg·mL－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度 分別取低（0.502μg·mL－1）、中（20.08μg·mL－1）、高（80.32μg·mL－1）3個(gè)濃度的樣品溶液，一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定5 d，SPD的日內(nèi)、日間RSD均＜2%，符合要求。

2.1.4 回收率 取空白納米粒膠體溶液1 mL，分別加入0.05、2、8 mL的SPD標(biāo)準(zhǔn)母液，加甲醇適量于超聲機(jī)中超聲消解，靜置后，用甲醇定容至10 mL，過0.45μm微孔濾膜，HPLC進(jìn)樣20μL，測(cè)定SPD的濃度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得低、中、高濃度的回收率：100.60%±1.92%、97.78%±1.25%和99.00%±1.09%。

2.2 SPD－L100－55－NPs的制備

2.2.1 SPD－L100－55－NPs膠體溶液的制備采用改良乳化－溶劑擴(kuò)散法［9］制備SPD－L100－55－NPs。稱取L100－55與SPD溶解于無水乙醇中，作為有機(jī)相；另取F68溶于蒸餾水作為水相。在水浴和磁力攪拌下，將有機(jī)相快速注入水相中，攪拌反應(yīng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)入到高溫度水浴中，繼續(xù)攪拌以揮發(fā)有機(jī)溶劑，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，即得納米粒膠體溶液。

2.2.2 SPD－L100－55－NPs凍干粉的制備 取SPD－L100－55－NPs膠體溶液，超濾濃縮至原體積的十分之一。取10%甘露醇溶液1 mL加入到3 mL上述納米粒濃縮液中，混勻，分裝于西林瓶中，至－70℃低溫冰箱，冷凍24 h，迅速轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)中，干燥28 h后即得。

2.3 納米粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 粒徑和多分散系數(shù)的測(cè)定 取適量納米粒膠體溶液用激光散射粒度分析儀測(cè)定粒徑和多分散系數(shù)（P.I.）。

2.3.2 包封率的測(cè)定 取適量新鮮制備的SPDL100－55－NPs膠體溶液置于離心管中，低溫超速離心45 min（30 000 rpm，4℃），分取20μL上層清液進(jìn)樣，測(cè)定，經(jīng)換算即得游離藥量；取1mL納米粒膠體溶液加入甲醇超聲消解后，取20μL進(jìn)樣，經(jīng)換算得納米粒溶液中SPD含量即為總投藥量。按下列公式計(jì)算納米粒的包封率（EE）。

2.4 單因素考察納米粒的制備工藝 通過考察丙烯酸樹脂L100－55用量（100 mg）、SPD用量（40 mg）、有機(jī)相／水相比例（1∶5）、F68用量（200 mg）、攪拌速度（500 rpm）、揮發(fā)時(shí)間及溫度（3 h，50℃）、針頭大小及注入速度（7＃，15 s）等因素，以EE、平均粒徑和P.I.為指標(biāo)，初步篩選制備納米粒的處方及工藝條件。括號(hào)中數(shù)據(jù)為考察其他因素時(shí)該因素的固定水平，若單因素考察后結(jié)果與所固定得數(shù)據(jù)相左，則選用考察后的較優(yōu)水平。

2.4.1 丙烯酸樹脂L100－55用量的考察 L100－55分別稱取100、125、150、175、200 mg，制備納米粒，結(jié)果見表1。隨著L100－55用量增加，粒徑逐漸增大，P.I.先減小后增大，EE則減小，故其用量不宜過大，在100～150 mg時(shí)較優(yōu)。綜合考慮，L100－55用量為125 mg較為適宜。

表1 L100－55用量的考察

2.4.2 SPD用量的考察 SPD分別取10、20、30、40、50 mg，制備納米粒，結(jié)果見表2。隨著SPD用量的增加，納米粒粒徑變化不是太大，P.I.值先增大后降低，EE逐漸增大后變化不大，故SPD用量可適當(dāng)增加，暫定SPD用量為50 mg。

表2 SPD用量的考察

2.4.3 有機(jī)相／水相的考察 無水乙醇／水的比例分別為0.5∶5、1∶5、1.5∶5、2∶5，其中水相為50 mL不變，制備納米粒，結(jié)果見表3。由表可見，在1∶5～2∶5之間，EE變化不大，納米粒粒徑和P.I.值都增大，故選取有機(jī)相／水相比例為不宜過大，初步確定比例為1∶5。

表3 有機(jī)相／水相比例的考察

2.4.4 F68用量的考察 分別取50、100、150、200、250、300 mg的F68，制備納米粒，結(jié)果如表4?？梢奆68在100～250 mg范圍內(nèi)形成的納米粒較多，粒徑分布均勻。綜合考慮，F(xiàn)68用量確定為200 mg。

表4 F68用量的考察

2.4.5 揮發(fā)時(shí)間的考察 在50℃條件下，考察有機(jī)相揮發(fā)時(shí)間，制備納米粒，結(jié)果如表5。可知有機(jī)溶劑在揮發(fā)溫度在50℃、揮發(fā)時(shí)間為3 h時(shí)，粒徑較小，EE高，P.I.值較小，粒徑分布較集中。

表5 揮發(fā)時(shí)間的考察

2.4.6 注入速度與針頭大小的考察 分別用三種型號(hào)針頭，三種注入速度將有機(jī)相勻速注入水相，制備納米粒，結(jié)果見表6。由此可知針頭大小和注入速度對(duì)EE和粒徑影響不大，選取較小的P.I.值，故有機(jī)相選用7＃針頭在15 s內(nèi)勻速注入。

表6 注入速度與針頭大小的考察

2.4.7 轉(zhuǎn)速的考察 在不同磁力攪拌速度下，制備納米粒，結(jié)果見表7?？芍D(zhuǎn)速對(duì)EE影響較小，對(duì)粒徑、P.I.值有影響，故轉(zhuǎn)速選用較優(yōu)的500 rpm。

表7 轉(zhuǎn)速的考察

2.5 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化SPD－L100－NPs制備工藝

綜合單因素考察的數(shù)據(jù)，選取了A：SPD用量、B：有機(jī)相／水相比例和C：F68用量三個(gè)影響較大的因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，使用L9（33）正交表（表8）進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。以a：EE、b：平均粒徑和c：P.I.為指標(biāo)，分別給3個(gè)指標(biāo)0.5、0.3、0.2的權(quán)重，采用綜合加權(quán)評(píng)分法［10，11］，由于平均粒徑、P.I.越小越優(yōu)，所以綜合評(píng)分＝a／amax×100×0.5＋bmin／b ×100×0.3＋cmin／c×100×0.2，結(jié)果見表9。

表8 正交設(shè)計(jì)因素水平表

表9 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表10 方差分析表

通過直觀分析，各因素對(duì)指標(biāo)的影響大小順序依次為A＞B＞C，三因素的最佳組合為A1B3C1，即SPD用量為50 mg、F68用量為250 mg、有機(jī)相與水相的比例為1∶5。方差分析結(jié)果（表10）表明，A因素即SPD用量各水平間具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取125 mg丙烯酸樹脂L100－55與50 mg的SPD溶解于10 mL無水乙醇中，超聲溶解后，作為有機(jī)相；另將250 mg泊洛沙姆188溶于50 mL蒸餾水中作為水相。在30℃水浴、500 rpm磁力攪拌下，將有機(jī)相快速注入水相中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min后，轉(zhuǎn)入到60℃水浴中，攪拌3 h以揮發(fā)有機(jī)溶劑，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，即得SPD－L100－55－NPs膠體溶液。平行制備3批SPDL100－55－NPs，各項(xiàng)指標(biāo)見表11，粒徑分布見圖1。測(cè)得包封率98.91%±0.18%，平均粒徑（63.5± 3.6）nm，P.I.值0.198±0.014，綜合評(píng)分98.92，均優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)中的9個(gè)處方工藝。

表11 優(yōu)化工藝制備的納米粒的各項(xiàng)指標(biāo)

圖1 SPD－L100－55－NPs粒徑分布圖

2.7 SPD－L100－55－NPs納米粒的表征

2.7.1 納米粒形態(tài)觀察 將SPD－L100－55－NPs膠體溶液點(diǎn)樣于銅網(wǎng)上，經(jīng)2%的磷鎢酸復(fù)染后，用濾紙吸干染液，自然干燥后，置于透射電鏡下觀察。納米粒的透射電鏡照片見圖2，可見納米粒形態(tài)圓整，粒徑分布集中，且與激光粒度分析儀的測(cè)定結(jié)果相近。

圖2 SPD－L100－55－NPs透射電鏡照片

2.7.2 FT－IR分析 取L100－55、SPD、SPDL100－55物理混合物、Fd－SPD－L100－55－NPs加入適量KBr壓片，測(cè)得如圖3的紅外譜圖。L100－55曲線中有兩個(gè)特征峰：3 499 cm－1ν（－OH），1 753 cm－1δ（－C＝O）。NPs中的O－H伸縮振動(dòng)吸收峰紅移至3 305 cm－1處，向低波數(shù)位移了194 cm－1，這表明形成了一定強(qiáng)度的分子內(nèi)和分子間氫鍵；1 753 cm－1處的尖峰強(qiáng)度降低，并有新的吸收峰出現(xiàn)。表明形成了新的物相，掩蓋了藥物峰，藥物被包裹形成納米粒。

圖3 紅外光譜圖

2.7.3 DSC分析 分別稱取L100－55、SPD、SPD－L100－55物理混合物、Fd－SPD－L100－55－NPs約1.0 mg。測(cè)試條件：采用熱流型測(cè)量方法，以空白鋁坩堝為參比物，掃描速度為20℃·min－1，掃描范圍為0～300℃。得到熱流型DSC曲線，見圖4。NPs的DSC曲線在158.11和168.45℃處分別出現(xiàn)一新的吸熱峰，且SPD（63.47、221.55℃）、S100（68.66、217.06℃）和SPD－L100－55 Mixture（70.78、222.03℃）的原吸熱峰被掩蓋或被削弱，與NPs曲線有顯著的不同，表明生成了新的物相，即有納米粒形成，結(jié)果與FT－IR一致。

圖4 DSC曲線圖

2.7.4 XRD分析 對(duì)L100－55、SPD、SPD－L100－55物理混合物、Fd－SPD－L100－55－NPs進(jìn)行X衍射。條件為：Cu靶／石墨單色器，電壓30 kV，電流20 mA，掃描速度0.1°·s－1，采樣時(shí)間1 s，掃描范圍5～50°。得X－射線衍射圖譜見圖5。對(duì)比圖a、b、c、d可見，納米粒圖譜中L100與SPD的特征吸收峰均消失，且有新的峰出現(xiàn)，表明L100與SPD之間發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用，形成了無定形粉末，載藥納米粒藥物峰消失，提示藥物已被包裹其中。與FT－IR和DSC的分析結(jié)果一致。

圖5 X射線衍射圖

2.8 SPD－L100－55－NPs的體外釋放特性 采用動(dòng)態(tài)透析法，取納米粒濃縮液2 mL，置于透析袋中，扎緊兩端，分別固定于40%乙醇pH 1.2鹽酸溶液和40%乙醇磷酸鹽緩沖溶液（pH 5.0、6.8、7.4、8.0）200 mL的釋放瓶中，置于（37±0.5）℃的恒溫振蕩器中，100 rpm振蕩。于不同時(shí)間點(diǎn)分別取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)加2 mL相應(yīng)的同溫釋放介質(zhì)。樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液20μL進(jìn)樣，HPLC測(cè)定其中SPD的濃度，并計(jì)算其累積釋放百分率，繪制釋放曲線，結(jié)果見圖6。

圖6 SPD－L100－55－NPs的體外釋放曲線（n＝3）

從圖中可見：SPD－L100－55－NPs釋放呈現(xiàn)明顯的pH依賴性，藥物釋放率隨著pH值的升高而增大。10 h時(shí)在pH＜6.8的溶出介質(zhì)中，藥物釋放率均＜30%；在pH 6.8介質(zhì)中釋放34.8%；在pH＞6.8的介質(zhì)中釋藥較快，在8 h藥物累積釋放都達(dá)到80%以上。

3 討論

改良－乳化溶劑擴(kuò)散法適用于油脂溶性藥物和非水溶性載體材料制備納米粒，其原理為向水相中注入的有機(jī)相在乳化劑的作用下形成乳滴，在磁力攪拌作用下通過乳滴內(nèi)部乙醇和外部水相之間的逆向擴(kuò)散來包載藥物，在乙醇揮發(fā)的過程中形成納米粒子。本研究以水難溶性藥物SPD為模型藥物，非水溶性材料丙烯酸樹脂為載體，通過優(yōu)化制備工藝和處方設(shè)計(jì)制備了平均粒徑65 nm的納米粒子，包封率高達(dá)99%。

體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米粒釋藥具有pH敏感性和緩釋特性。雖然L100－55在pH 5.5以上的介質(zhì)中易于溶解，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在pH 6.8時(shí)藥物釋放緩慢，這樣在體內(nèi)可減少胃和小腸上段酶系對(duì)藥物的代謝作用，使SPD能夠在腸道最佳吸收部位達(dá)到較高濃度，提高其生物利用度。

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Preparation and in vitro evaluation of Saponins PD－Loaded Eudragit L100－55 Nanoparticles

LIYing1，2，YIN Hong-ran1，GENG Li-juan1，YOU Ben-gang1
（1.College of Pharmaceutical Science，Soochow University，Suzhou 215123，China；2.Suzhou Institute of Supervision and Inspection on Product Quality，Suzhou 215104，China）

ObjectiveTo prepare and in vitro evaluate Saponins PD loaded Eudragit L100－55 Nanoparticles（SPDL100－55－NPs）.MethodsThe SPD－L100－55－NPs were prepared bymodified quasiemulsion solvent diffusion technique.Taking particle size，entrapment efficiency and polydisperse index as comprehensive indexes，the orthogonal test design was used to optimize the preparation process.The characteristics of nanoparticles were determined by FT－IR，X－ray diffraction，DSC，etc.；In vitro releasewas investigated.ResultsNovel nanoparticleswere spherical，average particle size of nanoparticleswas（63.5±3.6）nm，EE 98.91%±0.18%，P.I.0.198±0.014.The release of SPD significantly depended on the pH conditions.ConclusionSPD－L100－55－NPs had high EE and homogeneous size distribution.The effect of drug sustained release of nanoparticleswas significant。

Saponins PD；Eudragit（L100－55）；Nanoparticles；Release

R944

A

2095－5375（2014）08－0464－006

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（No.81102818）

李穎，女，研究方向：藥物分析，E－mail：ly0825ant＠163.com

游本剛，男，博士研究生，講師，研究方向：中藥新劑型與新技，Tel：13814809871，E－mail：youbengang＠suda.edu.cn