不同廠家通便靈膠囊微生物限度檢查方法學驗證的探討

鄭兆顯，張秀花，李瑞英，邱權(quán)義，王玉芝

（菏澤市食品藥品檢驗中心，山東菏澤274032）

不同廠家通便靈膠囊微生物限度檢查方法學驗證的探討

鄭兆顯，張秀花，李瑞英，邱權(quán)義，王玉芝

（菏澤市食品藥品檢驗中心，山東菏澤274032）

目的通過對不同廠家同一品種的方法學驗證，建立通便靈膠囊微生物限度檢查方法。方法按《中國藥典》2010版的要求。通過接種代表性的陽性菌株，用常規(guī)法及培養(yǎng)基稀釋法對五株陽性菌進行回收率測定。結(jié)果該品種有抑菌性，采用培養(yǎng)基稀釋法對五株陽性菌株回收率均高于70%。結(jié)論本樣品微生物限度檢查中，細菌檢查可用培養(yǎng)基稀釋法，霉菌酵母菌及控制菌檢查可采用常規(guī)法。

通便靈膠囊；微生物限度檢查；回收率；方法學驗證

通便靈膠囊由番瀉葉、當歸、肉蓯蓉三味中藥組成，具有泄熱導滯，潤腸通便的功效，主要用于熱結(jié)便秘、長期臥床便秘、一時性腹脹便秘、老年習慣性便秘等［1］。本品屬純中藥制劑，副作用小價格便宜，是國家基本藥物，使用量大，越來越受到患者的關(guān)注。筆者通過全國八家藥品生產(chǎn)企業(yè)提供的微生物學方法驗證資料發(fā)現(xiàn)（附表1），其中4家采用常規(guī)法，4家采用培養(yǎng)基稀釋法。

1 實驗材料

1.1 樣品 樣品1：通便靈膠囊，濟南利蒙制藥有限公司（批號：13030203）；樣品2：通便靈膠囊，新鄉(xiāng)恒久遠藥業(yè)有限公司（批號：20111201）；樣品3：通便靈膠囊，天津飛鷹制藥有限公司（1112010）；樣品4：通便靈膠囊，安徽濟人藥業(yè)有限公司（批號：121103）；樣品5：通便靈膠囊，貴州恒和制藥有限公司（批號：130106）；樣品6：通便靈膠囊，上海北杰集團關(guān)東藥業(yè)有限公司（批號：20121001）；樣品7：通便靈膠囊，廣西迪泰制藥有限公司（批號：20130901）；樣品8：通便靈膠囊，景忠山國藥（唐山）有限公司（批號：130302）。

1.2 菌株 大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］，白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］，黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］。以上菌株均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養(yǎng)基與稀釋液 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：20130517）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：20130107）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：20130212）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號：20121026）、pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號：130201）等均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.4 儀器 JY2002電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；YXQ－LS－505II立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ClassⅡBSC生物安全柜（新加坡ESCD公司）；ZF－2三用紫外線分析儀（上海永亭電子儀器廠）；BPH－9272精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 將上述5種菌株的新鮮培養(yǎng)物分別接種至規(guī)定培養(yǎng)基中，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24 h、白色念珠菌培養(yǎng)48 h，黑曲霉培養(yǎng)5～7 d，按《中國藥典》2010年版（一部）［2］附錄方法制備菌（孢子）懸液，平行測定2皿培養(yǎng)計數(shù)，制成約為50～100 cfu·mL－1，備用。

2.2 供試液制備 取通便靈膠囊10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，制成1∶10供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證

2.3.1 常規(guī)法 取“2.2”中供試液注皿，每皿1 mL，分別加入5株試驗菌，測定回收率；同時做菌液組、稀釋劑對照組及供試品的本底菌數(shù)，結(jié)果見表2。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 取“2.2”中供試液注皿，每皿0.2 mL，分別加入5株試驗菌，測定回收率；同時做菌液組、稀釋劑對照組及供試品的本底菌數(shù)，結(jié)果見表3。

2.4 控制菌檢查方法的驗證，結(jié)果見表4。

2.4.1 供試品組 取“2.2”中供試液10 mL加入增菌液中，依相應(yīng)控制菌檢查方法檢查，大腸菌群檢查所加試驗菌為大腸埃希菌。

2.4.2 試驗組 取“2.2”中供試液10 mL及大腸埃希菌液10～100 cfu，加入增菌液中，依相應(yīng)控制菌檢查方法檢查。

2.4.3 陰性菌對照組 取金黃色葡萄球菌液10～100 cfu加入增菌液中，依相應(yīng)控制菌檢查方法檢查。

2.4.4 陰性對照組 取稀釋液10 mL按相應(yīng)控制菌檢查方法檢查。

表1 全國8家生產(chǎn)企業(yè)提供的微生物學方法驗證及結(jié)果

表2 常規(guī)法試驗組的菌數(shù)回收率（%）

表3 培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL／皿）試驗組的菌數(shù)回收率（%）

表4 常規(guī)法控制菌的方法驗證

3 討論

3.1 微生物限度檢查法是檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受污染程度的方法［3］。進行藥品微生物限度檢查時，如果供試品有抑菌活性，應(yīng)采用適宜的方法消除供試液的抑菌活性，再依法進行檢驗。［4］由于各個品種微生物指標不同，同品種不同廠家生產(chǎn)工藝也不一定完全相同，藥典中微生物限度檢查法未分列于各品種項下［5］，因此，針對同品種不同廠家也應(yīng)分別進行方法學驗證，以確保方法的可靠性。

3.2 從表1可看出，同一品種不同廠家，驗證方法略有不同。針對此問題我們分別用兩種方法進行了驗證。從表3可看出，稀釋劑對照組的回收率均不低于于70%，說明符合驗證要求，實驗結(jié)果成立。從表2、表3可看出，兩種方法的實驗結(jié)果有顯著差異，常規(guī)法大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿回收率有4家低于70%，白色念珠菌、黑曲霉回收率均不低于70%；培養(yǎng)基稀釋法5種菌株的回收率均在90%左右，由此可見本品采用培養(yǎng)基稀釋法進行微生物限度檢查結(jié)果比較可靠。

3.3 通過比較分析，8家藥品生產(chǎn)企業(yè)均采用的是同一標準，制備方法完全一致。由于生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)工藝、藥材產(chǎn)地、培養(yǎng)基靈敏度等不同，最后導致方法學驗證結(jié)果不一致。由此可見，當產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準——中藥成方制劑（第七冊）［S］.北京：國家藥典委員會，1993.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010版（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄79.

［3］ 王偉嬌，葛朝霞.頭孢氨芐甲氧芐啶膠囊微生物限度檢查方法驗證［J］.中國藥品標準，2007，8（5）：50－54.

［4］ 袁林娜.布洛偽麻膠囊微生物限度檢查方法驗證試驗研究［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學雜志，2007，24（3）：229－231.

［5］ 杜鵑，范兵，馮慰民，等.三類不同藥品的微生物限度檢驗方法驗證比較［J］.藥物分析雜志，2006，26（6）：840－842.

Study on the validation ofm icrobial lim it testmethod for Tongbianling Capsules of differentmanufactures

ZHENG Zhao-xian，ZHANG Xiu-hua，LIRui-ying，QIU Quan-yi，WANG Yu-zhi
（Heze Center for Food and Drug Control，Heze 274032，China）

ObjectiveTo establish amicrobial limit testmethod of Tongbianling Capsules through the validation of differentmanufacturers of the same species verificationmethodology.MethodsThe recovery percent of five positive bacteria wasmeasured by inoculating representative positive strains using routinemethod and culturemedium dilutionmethod as the requirements of Chinese Pharmacopoeia，2010.ResultsThe studied object had antimicrobial properties and the recovery percent of the five positive bacteria are higher than 70%using culturemedium dilutionmethod.ConclusionBacteria detection can be tested by the culturemedium dilutionmethod，mold，yeast and control bacteria can be tested by routinemethod.

Tongbianling capsules；Microbial limit tests；Recovery；Methodology validation

R927.12

A

2095－5375（2014）08－0459－003

鄭兆顯，男，副主任藥師，研究方向：藥品檢驗，E－mail：zzx5067616＠126.com