異煙酸－吡唑啉酮比色法測定咖啡因中殘留氰化物

杜傳強，聶 磊

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南250012；2.山東新華制藥股份有限公司，山東淄博255000）

異煙酸－吡唑啉酮比色法測定咖啡因中殘留氰化物

杜傳強1，2，聶 磊1

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南250012；2.山東新華制藥股份有限公司，山東淄博255000）

目的采用異煙酸－吡唑啉酮比色法測定咖啡因中殘留氰化物。方法在中性條件下，氰化物與氯胺T反應(yīng)生成氯化氰，再與異煙酸作用，經(jīng)水解后生成戊烯二醛，最后與吡唑啉酮縮合生成藍色染料，在638 nm處的吸光度與氰化物含量成正比。結(jié)果氰化物濃度在0.007 74～0.193 44μg·mL－1范圍內(nèi)具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 97，平均回收率為100.2%（RSD＝0.49%，n＝9）。結(jié)論該方法靈敏、準確，適用于咖啡因中氰化物的測定。

異煙酸－吡唑啉酮比色法；咖啡因；氰化物

氰化物具有很強的毒性，其毒性跟CN－對重金屬離子的超強絡(luò)合能力有關(guān)，CN－主要跟細胞色素P450中的金屬離子結(jié)合，從而使其失去在呼吸鏈中起到的傳遞電子能力，進而使中毒者死亡。然而，氰化物在有機合成中是非常有用的試劑，常用來在分子中引入一個氰基，生成有機氰化物，咖啡因合成工藝中就用到氰化鈉引入氰基，因此CN－有可能在咖啡因原料藥中殘存?？紤]到氰化物的毒性，需要開發(fā)準確、可靠的分析方法用于檢測成品咖啡因中的殘留氰化物含量，以確?？Х纫蛑袣埩舻那杌锊粫θ梭w產(chǎn)生危害。我們采用異煙酸－吡唑啉酮比色法［1～7］測定咖啡因中殘留的氰化物含量，通過對該分析方法的專屬性、精密度、線性、范圍、準確度及耐受性進行驗證［8］，說明該方法適用于咖啡因中氰化物的測定。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 島津UV2450紫外分光光度計，Mettler AE240電子天平。

1.2 試藥

1.2.1 磷酸鹽緩沖液 稱取34.0 g無水KH2PO4和35.5 g無水Na2HPO4于一燒杯中，加水溶解。用2%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH＝7（電位法），用水稀釋至1 000 mL，搖勻放入冰箱。

1.2.2 1%（m／V）氯胺T溶液：臨用前，稱取0.5 g氯胺T，加水溶解并稀釋至50mL，搖勻，儲存于一棕色瓶中。

1.2.3 異煙酸－吡唑啉酮溶液 稱取1.5 g異煙酸，用24 mL 2%NaOH溶液溶解，加水稀釋至100 mL，搖勻，于棕色瓶中避光保存。稱取0.25 g吡唑啉酮，加入20 mL N，N－二甲基甲酰胺溶解，于棕色瓶中避光保存，臨用前，將異煙酸溶液和吡唑啉酮溶液以5∶1混合。

1.2.4 氰化鉀標準液（1 mL約含1.00μg氰離子）。

2 線性方程測定

取氰化鉀標準液0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于8個25 mL容量瓶中，分別加入0.1%氫氧化鈉溶液至10 mL，再分別加入5 mL磷酸鹽緩沖液，混勻。迅速加入0.2 mL 1%氯胺T溶液，立即蓋塞，混勻，放置3～5 min。向各管中加入5 mL異煙酸－吡唑啉酮溶液，混勻，加水稀釋至刻線，搖勻，在25～35℃的水浴中放置40 min。用分光光度計在638 nm波長處，未加入氰化鉀標準液瓶做空白，測量吸光度，并以測定的吸光度為縱坐標，以氰離子濃度為橫坐標做線性方程。

3 樣品的測定方法

精確稱量10 g咖啡因，于一150 mL錐形瓶中。加入30 mL 0.1%氫氧化鈉溶液振搖10 min。過濾到50 mL容量瓶中，用少量0.1%氫氧化鈉溶液洗滌數(shù)次，并稀釋至刻度。取2個25 mL容量瓶，其中一瓶加入咖啡因溶液5 mL，然后向兩瓶中加入0.1%氫氧化鈉溶液5 mL，再向兩瓶中分別加入5 mL磷酸鹽緩沖液，混勻，迅速加入0.2 mL 1%氯胺T溶液，立即蓋塞，混勻，放置3～5 min。向各瓶中加入5 mL異煙酸－吡唑啉酮溶液，混勻，加水稀釋至刻度，搖勻，在25～35℃的水浴中放置40 min。用分光光度計在638 nm波長處，未加樣品瓶做空白，測量吸光度?？Х纫蛑星杌锏暮堪聪率接嬎悖?/p>

式中A為測量樣品的吸光度，a，b和c分別為回歸方程截距，回歸方程斜率及每克咖啡因中含有的氰化物（CN－，μg）。

4 方法驗證

4.1 專屬性 稱量10 g咖啡因，照“3”項下操作得咖啡因溶液。取7個25 mL容量瓶，分別加入氰化鉀標準溶液0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0 mL，后3個容量瓶各加入5 mL咖啡因溶液，然后照“3”項下操作，測量吸光度分別為0.150、0.150、0.149、0.150、0.150、0.150，由此證明加入咖啡因?qū)ξ舛葻o影響，專屬性符合要求。

4.2 精密度

4.2.1 重復(fù)性 取10個25 mL容量瓶，分別加入氰化鉀標準溶液0、1.0、1.0、1.0、2.0、2.0、2.0、3.0、3.0、3.0 mL，然后各瓶加入0.1%氫氧化鈉溶液至10 mL。再照“3”項下操作，測量吸光度，計算吸光度與濃度比值（A／C）的相對標準偏差（RSD）＝0.24%＜2.0%，重復(fù)性符合要求。

4.2.2 中間精密度 同一個實驗室內(nèi)，不同分析人員，不同時間，操作方法同“4.2.1”項下，A／C的RSD＝0.29%＜2.0%，中間精密度符合要求。

4.3 線性及范圍 取8個25 mL容量瓶，分別加入氰化鉀標準溶液0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，然后各瓶加入0.1%氫氧化鈉溶液至10 mL。再照“3”項下操作，測量吸光度，利用ORIGIN 5.0軟件，以吸光度對氰離子濃度（μg·mL－1）做線性方程：A＝0.000 860 215＋3.831 05C（r＝0.999 97），氰離子濃度在0.007 74～0.193 44μg·mL－1范圍內(nèi)具有良好的線性。

4.4 檢測限與定量限 依據(jù)校正曲線，吸收度的標準偏差SD＝0.002 31，校正曲線斜率S＝3.831 05計算得到檢測限（LOD）＝3.3×SD／S＝0.001 99μg ·mL－1；定量限（LOQ）＝10×SD／S＝0.006 03μg ·mL－1。

4.5 回收率 取10個25 mL容量瓶，分別加入氰化鉀標準溶液0、1.0、1.0、1.0、2.0、2.0、2.0、3.0、3.0、3.0 mL，然后各瓶加入0.1%氫氧化鈉溶液至10 mL。再照“3”項下操作，測量吸光度，依據(jù)線性方程求出氰離子的測量濃度，與加入氰離子的濃度相比即為回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果

4.6 耐受性 取2個25 mL容量瓶，分別加入氰化鉀標準液0、1.0 mL，然后各瓶加入0.1%氫氧化鈉溶液至10 mL。再照“3”項下操作，顯色完畢，分別測量放置0、10、20 min時的吸收度，無差異，說明顯色完畢放置適當(dāng)時間測量，不影響測定結(jié)果，耐受性符合要求。

5 咖啡因樣品測定

取5個連續(xù)批次的咖啡因，照“3”項下操作，測定結(jié)果見表2。

表2 咖啡因中殘留氰化物的測定

5個連續(xù)批次的咖啡因均未檢出氰化物，說明咖啡因中不含有氰化物。

6 結(jié)論

用異煙酸－吡唑啉酮比色法測定咖啡因中殘留氰化物含量，不受樣品干擾，回收率高，重現(xiàn)性好，測定結(jié)果準確可靠，該法適用于咖啡因中殘留氰化物的測定。同時為其他產(chǎn)品中氰化物含量測定提供參考。

［1］ 國家環(huán)境保護局.水質(zhì)氰化物的測定第二部分：氰化物的測定［S］.GB／T 7487－1987，1987.

［2］ 郭東華，劉賢文，王春生，等.異煙酸－吡唑啉酮分光光度法測定硫氰酸根用于油水井間示蹤［J］.油田化學(xué)，2007，24（4）：304－306.

［3］ 馮翠霞，林麗玲，黃輝濤.分光光度法測定尿中硫氰酸鹽的異煙酸－吡唑酮［J］.中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2009，36（6）：501，504.

［4］ 金愛武.唾液中硫氰酸鹽的吡啶－巴比妥酸分光光度測定方法［J］.勞動醫(yī)學(xué)，1999，16（3）：176.

［5］ 騰根發(fā)，虞雄華.牛奶中硫氰酸鹽的測定［EB／OL］.2011－3－28.http：／／www.sepu.net／down／showdown.asp？id＝2199.

［6］ 李衛(wèi)群，單勝艷，朱慧.分光光度法測定乳與乳制品中硫氰酸鈉的含量［J］.中國食品添加劑，2010，（3）：240－243.

［7］ 伍金娥，常超，胡海瓊，等.紫外分光光度法測定摻假牛奶中的硫氰酸鈉含量［J］.武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2010，29（2）：1－3.

［8］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（二部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄194－195.

Determ ination of cyanide in caffeine by isonicotinic acid－pyrazolone colorimetricmethod

DU Chuan-qiang1，2，NIE Lei1
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Shandong Xinhua Pharmaceutical Co.，Ltd.，Zibo 255000，China）

ObjectiveUsing isonicotinic acid－pyrazolone colorimetricmethod for the content determination of CN－in Caffeine.MethodsIn neutralmedium，the cyanide reacted with chloramine T to form cyanogen chloride.Cyanogen chloride reacted with isonicotinic acid and then hydrolyzed to form glutaconaldehyde which reacted with pyrazolone to form blue dye.The cyanide content had positive correlation with absorbance of the blue dye at 638 nm.ResultsThe range of linear relationship of cyanide was 0.007 74～0.193 44μg·mL－1（r＝0.999 97）.The average recovery was 100.2%（n＝9）；The relative standard deviation was0.49%.ConclusionThemethod was sensitive and accurate，which was suitable for the determination of cyanide in caffeine.

Isonicotinic acid－pyrazolone colorimetricmethod；Caffeine；Cyanide

R927.1

A

2095－5375（2014）08－0454－003

杜傳強，男，研究方向：藥物分析，E－mail：164380065＠qq.com

聶磊，男，博士研究生，副教授，研究方向：中藥質(zhì)量評價，Tel：0531－88382330，E－mail：nielei2004＠sdu.edu.cn