枸杞多糖對(duì)自身免疫性卵巢早衰模型小鼠的保護(hù)作用

黃 恬，鄭曉霞，邱小華，王 艷

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣東汕頭515041）

枸杞多糖對(duì)自身免疫性卵巢早衰模型小鼠的保護(hù)作用

黃 恬，鄭曉霞，邱小華，王 艷

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣東汕頭515041）

目的探討枸杞多糖對(duì)自身免疫性卵巢早衰小鼠的保護(hù)作用。方法以小鼠免疫性卵巢早衰模型模擬卵巢早衰，研究枸杞多糖對(duì)小鼠免疫性卵巢早衰模型動(dòng)情周期、體重、血清抗透明帶抗體、血卵泡刺激素（FSH）及雌二醇（E2）濃度的影響。結(jié)果與模型組比較，枸杞多糖治療組能改善了小鼠的性周期紊亂，降低血清抗透明帶抗體、FSH的濃度，提高血清E2的濃度，并在第7周至第8周時(shí)增加體重。結(jié)論枸杞多糖對(duì)自身免疫性卵巢早衰具有保護(hù)作用。

枸杞多糖；卵巢早衰；小鼠

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40歲前由于卵巢內(nèi)卵泡耗竭或醫(yī)源性損傷導(dǎo)致的卵巢功能衰竭，以雌激素（E2）降低伴有卵泡刺激素（FSH）和促黃體生成素（LH）升高為特征［1］。POF的發(fā)病率為1%～3%，占繼發(fā)性閉經(jīng)的10%～20%［2～4］，由于病因不明，治療頗為棘手，尚無有效措施。POF具有腎虛血虧血瘀的病機(jī)特點(diǎn)［5］，因此補(bǔ)腎、養(yǎng)血、活血成為治療該病的關(guān)鍵［6］。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是從寧夏特色植物枸杞（Lycium bararum）中分離出的主要多糖之一，具有養(yǎng)陰補(bǔ)血、滋補(bǔ)肝腎、益精明目之功效，故可能對(duì)自身免疫性POF具有治療作用。本研究擬通過小鼠免疫性卵巢早衰模型，觀察LBP對(duì)卵巢早衰治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 C57BL小鼠，雌性，15～18 g，72只，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2006－0015。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料 Model 680酶標(biāo)儀（Bio－Rad公司）；Pzp3：小鼠透明帶3（ZP3）的多肽片段，為ZP3的第330－342個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為：Asn－Ser－Ser－Ser－Ser－Gln－phe－Gln－Ile－His－Gly－pro－Arg（杭州中肽生物有限公司，批號(hào)：CC－11－030）。弗氏完全佐劑（Sigma公司，批號(hào)：038K8726）；弗氏不完全佐劑（Sigma公司，批號(hào)：086K8905）。兔抗小鼠Azpab抗體ELISA試劑盒（美國ADL公司）。小鼠血卵泡刺激素及雌二醇水平ELISA試劑盒（美國DRG公司）；枸杞多糖（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：91087，純度＞98%）；醋酸潑尼松片（廣東三才石岐制藥有限公司，批號(hào)：200703116）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠免疫性卵巢早衰模型建立［7］C57BL小鼠72只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組12只和造模組60只。稱取1 mg的Pzp3粉末，加入三蒸水配成0.2 mg·mL－1的Pzp3溶液。造模組按文獻(xiàn)方法，以Pzp3溶液在足底及腹部皮膚皮下多點(diǎn)注射，每2周1次，共注射3次，第1次加入等量弗氏完全佐劑，第2次和第3次加入等量弗氏不完全佐劑以制備免疫性POF動(dòng)物模型，空白對(duì)照組同時(shí)給予相同體積生理鹽水。

2.2 動(dòng)物分組 造模之日起，每天下午3點(diǎn)陰道脫落細(xì)胞涂片觀察小鼠動(dòng)情周期的變化。將造模組隨機(jī)分為模型組、LBP高、中、低劑量組（60、30、15 mg ·kg－1）、潑尼松陽性對(duì)照組（4 mg·kg－1），每組12只。各給藥組于第三次免疫后，按10 mL·kg－1灌胃給藥，空白對(duì)照組和模型組給予相同體積生理鹽水，共連續(xù)給藥4周，每周稱重1次。

2.3 陰道脫落細(xì)胞檢測 每天下午3點(diǎn)取各組小鼠做陰道脫落細(xì)胞涂片。以生理鹽水潤濕棉簽，取陰道脫落細(xì)胞涂于載玻片，自然干燥，甲醇固定1 h，室溫自然干燥，Giemsa染色20 min，0.01 mol·L－1PBS沖洗3次，光學(xué)顯微鏡觀察其動(dòng)情周期變化。

2.4 ELISA法檢測小鼠血清AzpAb、FSH及E2濃度 最后一次給藥后，小鼠摘眼球取血，離心后取上清液，按ELISA法檢測外周血中AzpAb、FSH和E2濃度。從4℃冰箱拿出試劑盒，室溫下平衡1 h。從－20℃冰箱拿出樣本，置于4℃解凍。按照100 μL／孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)品（AzpAb濃度為0、5、10、25、50、100 pg·mL－1，F(xiàn)SH濃度為0、5、10、25、50、100 m IU·mL－1，E2濃度為0、8、24、80、160、320 m IU· mL－1，每個(gè)濃度做2個(gè)重復(fù)對(duì)照）、待測血清樣品，設(shè)4個(gè)空白對(duì)照孔（不加樣品，加0.01 mol·L－1PBS液）。加入50μL酶標(biāo)抗體，輕輕晃動(dòng)15 s，37℃孵育1 h。棄上清液，300μL／孔依次加入洗滌液，靜置30 s，棄洗滌液，濾紙上扣板清除洗滌余液，重復(fù)洗滌5次。每孔加底物溶液100μL顯色（A與B 1∶1混合），輕輕晃勻5 s，37℃孵育15 min。每孔加終止液50μL，輕輕晃動(dòng)30 s，以空白孔校零，30 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm處測定OD值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間多重比較采用ANOVA分析；兩樣本率的比較采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 LBP對(duì)小鼠免疫性卵巢早衰模型的性周期的改變的影響 對(duì)照組有83%（10／12）小鼠仍維持正常的性周期，而模型組僅有25%（3／12）小鼠性周期無明顯變化，各治療組比模型組情況有所好轉(zhuǎn)，分別為：小劑量治療組41%（5／12）、中劑量治療組58%（7／12）、大劑量治療組75%（9／12）、潑尼松陽性對(duì)照組75%（9／12）小鼠性周期無明顯改變。比較各組小鼠性周期紊亂比例，模型組與空白對(duì)照組之間差異顯著（P＜0.01），說明模型組小鼠總體的性周期發(fā)生紊亂。各治療組與模型組之間差異顯著，P＜0.01，提示各治療組改善小鼠的性周期紊亂（見表1）。

表1 對(duì)小鼠免疫性卵巢早衰模型的性周期的改變的影響（單位：只）

3.2 LBP對(duì)小鼠免疫性卵巢早衰模型的體重改變的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠在第3周至第8周的體重有顯著性降低體重（P＜0.05）；各給藥組小鼠在第3周至第6周的體重有顯著性降低體重（P＜0.05）。與模型組比較，LBP各給藥組及波尼松陽性對(duì)照組小鼠在第7周至第8周的體重顯著增加（P＜0.05），見圖1。

3.3 LBP對(duì)小鼠免疫性卵巢早衰模型的血清Az-pAb、FSH及E2濃度的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清抗透明帶抗體濃度有顯著性升高（P＜0.01）。與模型組比較，低劑量組小鼠血清抗透明帶抗體濃度顯著降低（P＜0.05），LBP中、高劑量組及波尼松陽性對(duì)照組小鼠血清抗透明帶抗體濃度顯著降低（P＜0.01），見圖2。

圖1 對(duì)小鼠免疫性卵巢早衰模型的體重改變的影響（ˉx，n＝12）

圖2 對(duì)小鼠免疫性卵巢早衰模型的血清抗透明帶抗體濃度的影響（±s，n＝12）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清FSH濃度有顯著性升高（P＜0.01）。與模型組比較，LBP各劑量組及波尼松陽性對(duì)照組小鼠血清FSH濃度顯著降低（P＜0.01），見圖3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清E2濃度有顯著性降低（P＜0.01）。與模型組比較，LBP中劑量組小鼠血清E2濃度顯著升高（P＜0.05），LBP高劑量組及波尼松陽性對(duì)照組小鼠血清E2濃度顯著升高（P＜0.01），見圖4。

4 討論

目前公認(rèn)為機(jī)體發(fā)生自身免疫異常，產(chǎn)生抗透明帶抗體是導(dǎo)致POF發(fā)生的一個(gè)重要原因［8］，而抗透明帶抗體又可以加速卵母細(xì)胞的破壞和耗竭而致POF，因此，本文根據(jù)這個(gè)機(jī)理參考文獻(xiàn)［7，9］，以透明帶的片段建立了小鼠的自身免疫性POF模型。本實(shí)驗(yàn)中POF模型組小鼠外周血中抗透明帶抗體濃度明顯高于對(duì)照，表明該方法能有效誘導(dǎo)抗透明帶抗體生產(chǎn)。小鼠的性周期相當(dāng)于人類的月經(jīng)周期，可以反映卵巢的功能［10］。本實(shí)驗(yàn)中POF模型組小鼠有75%發(fā)生性周期紊亂，且有25%性周期延長，表明小鼠的卵泡可能難以發(fā)育成熟或不能排卵，不能生成黃體，因而不出現(xiàn)動(dòng)情后期的表現(xiàn)，與POF患者的卵巢有卵泡丟失、閉鎖和無排卵相符合。以上結(jié)果說明該模型能夠很好的模擬POF的卵巢功能變化。

圖3 對(duì)小鼠免疫性卵巢早衰模型的血清FSH濃度的影響（±s，n＝12）

圖4 對(duì)小鼠免疫性卵巢早衰模型的血清E2濃度的影響（±s，n＝12）

我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎氣的盛衰直接關(guān)系到腎－天癸－沖任－胞宮生殖軸的功能狀態(tài)，對(duì)月經(jīng)的產(chǎn)生起著主導(dǎo)和決定作用。因腎藏精，主骨生髓，為免疫之本，只有在腎的涵養(yǎng)下，免疫系統(tǒng)才不至于成為無源之水，才能發(fā)揮正常的免疫作用。因此，腎主生殖及免疫。自身免疫性POF的病因病機(jī)特點(diǎn)是以腎陰虛為主，兼腎陽氣不足之腎虛為主導(dǎo)，血虛為基礎(chǔ)的腎虛血虧血瘀，Azpab的產(chǎn)生當(dāng)以腎虛為本。由于腎氣不足、腎精虧耗是自身免疫性POF的主要病機(jī)，因此補(bǔ)腎、養(yǎng)血活血成為治療該病的關(guān)鍵。枸杞在我國已有幾千年的藥用歷史，具有“滋陰補(bǔ)血，益精明目”之功效。近年來，大量研究表明，LBP為其主要的生物活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老等作用［11］。本研究顯示，與模型組小鼠比較，LBP治療組能改善了小鼠的性周期紊亂，降低血清抗透明帶抗體、FSH的濃度，提高血清E2的濃度，并在第7周至第8周時(shí)體重顯著增加，結(jié)果表明LBP具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能，減緩抗透明帶抗體所致的小鼠卵巢損傷，對(duì)卵巢功能有一定的保護(hù)作用。LBP的保護(hù)作用可能與其免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)，其機(jī)制可能為：一方面，直接作用于T細(xì)胞、B細(xì)胞等主要免疫活性細(xì)胞，調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能；另一方面，可能作用于下丘腦，通過神經(jīng)通路作用于免疫系統(tǒng)，從而發(fā)揮對(duì)整體免疫功能的調(diào)節(jié)作用［12］。

［1］ 樂杰，謝幸.婦產(chǎn)科學(xué)教師用書（本科臨床）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

［2］Orshan SA，F(xiàn)urniss KK，F(xiàn)orst C，et al.The lived experience of premature ovarian failure［J］.J Obstet Gynecol Neonatal Nurs，2001，30（2）：202－208.

［3］Pasquali EA.The impact of premature menopause on women′s experience of self［J］.JHolist Nurs，1999，17（4）：346－364.

［4］ 朱玲，羅頌平，許麗綿，等.左歸丸對(duì)卵巢早衰小鼠免疫功能的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（6）：1157－1160.

［5］ 朱玲，羅頌平.卵巢早衰的病因病機(jī)及其證治［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21（1）：143－144.

［6］ 陳秀芳.辨證治療卵巢早衰22例［J］.四川中醫(yī)，2000，18（1）：35－36.

［7］ 李娜.丙酸睪酮治療小鼠自身免疫性卵巢早衰及其機(jī)制的研究［D］.中南大學(xué)，2011.

［8］Kimura S，Matsumoto T，Matsuyama R，etal.Androgen receptor function in folliculogenesis and its clinical implication in premature ovarian failure［J］.Trends Endocrinol Metab，2007，18（5）：183－189.

［9］ 付莉.卵巢早衰動(dòng)物模型的建立及口服耐受治療自身免疫性卵巢早衰的相關(guān)研究［D］.長春：吉林大學(xué)，2005.

［10］金巖.小鼠發(fā)育生物學(xué)與胚胎實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

［11］齊春會(huì)，張永祥，趙修南，等.枸杞粗多糖的免疫活性［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2001，15（3）：180－184.

［12］李英杰，齊春會(huì)，張永祥.枸杞多糖免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國新藥雜志，2004，13（10）：882－886.

The protective effect of lycium barbarum polysaccharide on model of autoimmune premature ovarian failure in m ice

HUANG Tian，ZHENG Xiao-xia，QIU Xiao-hua，WANG Yan
（The Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College，Shantou 515041，China）

ObjectiveTo evaluate the protective effectof lycium barbarum polysaccharide（LBP）onmodel of autoimmune premature ovarian failure in mice.MethodsThe model of autoimmune premature ovarian failure was induced by Pzp3 to simulate the premature ovarian failure（POF）changes.The protective effects of LBPwere investigated in thismodel.ResultsLBP treatment significantly improved the estrous cycle disorder，reduced the levels of the serum AzpAb，follicle－stimulating hormone（FSH），enhanced the level of the serum estradiol（E2）and gained weight between the 7 weeks to 8 weeks as compared with themodel group.ConclusionLBP offerred therapeutic effect against Pzp3－induced autoimmune premature ovarian failure inmice.

Lycium barbarum polysaccharide；Premature ovarian failure；Mice

R285

A

2095－5375（2014）08－0437－004

廣東省中醫(yī)藥局科研基金（No.20111236）

黃恬，女，副主任醫(yī)師，研究方向：婦科內(nèi)分泌，E－mail：tian_stb＠163.com