益母草倍半萜化合物對大鼠凝血功能和子宮活動的影響

李夢婷，代良萍，彭堯，熊亮,2，駱華剛，謝曉芳,2

益母草為唇形科植物益母草Leonurus JaponicusHoutt.的新鮮或干燥地上全草，作為“上品”始載于《神農本草經》，味辛、苦、微寒，歸心、肝、膀胱經，具有祛瘀生新、活血調經的功效，是婦科常用藥物。目前市場以益母草開發(fā)的婦科中成藥，如益母草膏、益母草顆粒、益母草注射液等，均有良好的臨床療效?，F(xiàn)代藥理研究表明，益母草具有雙向調節(jié)子宮活動、防止血小板聚集作用[1]，但物質基礎不明。課題組在前期研究中首次從益母草中提取分離到倍半萜化合物，本課題初步研究其對子宮活動和凝血功能的影響，以探討益母草調經活血的物質基礎。

1 材料

1.1 藥物

Chamigrenal(以下簡寫為YMC-4)、(2S,5S)-2-hydroxy-2,6,10,10-tetramethyl-1-oxaspiro[4.5]dec-6-en-8-one（以下簡寫為YMC-6），由成都中醫(yī)藥大學中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地中藥化學實驗室從益母草藥材中提取得到，經HPLC、核磁共振技術等鑒定[2]，純度達99%以上。實驗前均用二甲基亞砜（DMSO）配置成1×10-2moL．L-1的貯備液，臨用前以去離子水稀釋成1×10-3moL．L-1使用。

1.2 動物

SD大鼠，清潔級，雌雄不拘（做子宮試驗者為全雌），體重200～240g，由成都中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心提供，質量合格證號：SCXK（川）2008-11。

1.3 試劑與儀器

二磷酸腺苷二鈉（ADP，美國sigma公司，批號SLBB1854V，臨用前去離子水配成0.5mg．mL-1），二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司），PT、aPTT、TT、Fbg試劑盒（德國Siemens 公司，批號分別為545487、547163A、42282、538043），縮宮素注射液（河南輔仁懷慶堂制藥有限公司，批號：1204021），NaCl、KCl、CaCl2、NaHCO3、葡萄糖（均由成都市科龍化工試劑公司生產，用于配制洛氏液，配制方法：1000 mL含NaCl 9.2 g、KC1 0.42 g、CaCl20.24 g、NaHCO30.15 g、葡萄糖1.0 g）。多通道血小板聚集儀（APACT/2型，德國蘭波），全自動血凝儀（CA-530 系列，日本Sysmex公司），十六道生理記錄系統(tǒng)（P13516型，澳大利亞Powerlab公司)，離體組織灌流系統(tǒng)（ML0186型，澳大利亞Powerlab公司）。

2 實驗方法

2.1 體外血小板聚集試驗

報道[3]，選用成年、健康SD大鼠，雌雄不拘，適應環(huán)境后，股動脈采血，以3.8%枸椽酸鈉與血液1∶9抗凝，800 r．min-1離心10 min制備富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP），剩余部分以3000 r．min-1離心10 min制備貧血小板血漿（plateletpoor plasma,PPP），以血球計數儀測定血小板濃度調整至血小板含量為200～300×109個/L。以PPP調零，取200 μL PRP加入比濁管中37℃溫育5 min，加入20 μL受試藥物溶液，使得YMC-4、YMC-6的終濃度均為1×10-5moL．L-1，空白組加入1%DMSO溶液?；靹蚝罄^續(xù)溫育5 min，然后加入ADP20 μL（終濃度為0.05 mg．mL-1）誘導聚集。用血小板聚集儀測定5 min內血小板最大聚集率（%）。

2.2 體外凝血試驗

參考文獻報道[3]，選用成年、健康SD大鼠，雌雄不拘，適應環(huán)境后，股動脈采血，以3.8%枸椽酸鈉與血液1∶9抗凝，以3500 r．min-1離心10min，收集血漿，按200 μL/管加入到樣品管中，并加入1×10-3moL．L-1的YMC-6藥液（藥物終濃度為1×10-5moL．L-1），混勻后溫育5 min，然后采用全自動血凝儀測定PT、aPTT、TT。

2.3 大鼠子宮活動試驗

分別觀察兩個倍半萜化合物對非痙攣子宮和痙攣子宮的影響。取健康、成年雌性未孕大鼠，實驗前2日每日灌胃戊酸雌二醇片16.7 mg．kg-1以造成動情期。參考文獻制備離體子宮[4]，于第3日頸椎脫臼處死動物，迅速剪開腹腔剖取子宮置于盛有洛氏液的玻璃皿，輕輕剝離子宮上附著的結締組織和脂肪組織，取中間段2～3 cm，一端固定于盛有洛氏液20 mL的浴槽，另一端連接張力換能器，浴槽為（37±0.5）℃，并通以（95% O2+5% CO2）的混合氣體，速度1～2個小氣泡/s，前負荷1g。用十六通道生理記錄系統(tǒng)記錄子宮收縮曲線。待曲線穩(wěn)定30 min后開始加藥，采用累加給藥方式給予1×10-3moL．L-1的YMC-4、YMC-6，給藥劑量為20 μL、20 μL、40 μL（即YMC-4和YMC-6的低、中、高劑量終濃度均為1.0×10-7moL．L-1、2.0×10-7moL．L-1、4.0×10-7moL．L-1），以相當于相同濃度的DMSO溶液（濃度為1.41×10-5moL．L-1、2.82×10-5moL．L-1、5.63×10-5moL．L-1）為溶劑對照組。每次加藥后記錄10 min子宮活動后再續(xù)加第2次、第3次，3次加完后用洛氏液沖洗3次，待曲線穩(wěn)定后，開始下一次給藥。大鼠痙攣性子宮試驗時，在給藥前先加入1U．mL-1縮宮素160 μL（終濃度為0.008U．mL-1）使子宮痙攣，記錄曲線10 min后，再加入80 μL YMC-4或YMC-6。以給藥前為基礎值，計算給藥后或者造模后藥物對子宮收縮幅度（最大值、最小值、平均值）、頻率和活動力的抑制率或興奮率（Δt），觀察藥物對正常狀態(tài)下和痙攣狀態(tài)下大鼠子宮活動的影響。子宮活動力、Δt計算方法：

子宮活動力=平均值×頻率

抑制率：Δt=（給藥前-給藥后）/給藥前×100%

興奮率：Δt=（造模后或給藥后-造模前）/造模前×100%

2.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件建立數據庫，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間的比較以單因素方差分析（one-way ANOVA）統(tǒng)計，結果以（x±s）表示，P＜ 0.05 為顯著性差異。

3 實驗結果

3.1 對血小板聚集率和體外凝血功能的影響

結果顯示，YMC-6在終濃度為1×10-5moL．L-1時，能明顯降低ADP誘導的體外大鼠血小板最大聚集率，縮短體外凝血時間PT，與溶劑對照組比較有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），且有延長PT、aPTT的趨勢。由于YMC-4得率少，未進行體外凝血功能測定，而對ADP誘導的血小板聚集率無明顯影響。結果見表1、2。

表1 YMC-6對體外血小板聚集和凝血功能的影響（±s）

表1 YMC-6對體外血小板聚集和凝血功能的影響（±s）

注：與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量 聚集率 PT aPTT TT（moL．L-1） （%） （s） （s） （s）溶劑對照 — 61.4±9.44 16.1±1.65 17.2±2.29 21.2±4.04 YMC-6 1×10-5 42.0±15.63** 16.2±1.79* 18.3±2.10 22.0±4.38

表2 YMC-4對ADP誘導的體外血小板聚集功能的影響（±s）

表2 YMC-4對ADP誘導的體外血小板聚集功能的影響（±s）

組別 劑量 樣本量 聚集率（moL．L-1） （N） （%）溶劑對照 — 10 44.2±12.2 YMC-4 1×10-5 10 43.9±12.3

3.2 對大鼠離體子宮活動的影響

由表3～表7可見，DMSO作為溶劑對大鼠離體子宮活動有抑制作用，隨著劑量的加大，其收縮幅度（最大值、最小值、平均值）和活動力的抑制率均逐漸增大，對收縮頻率影響不大；與給藥前比較，YMC-4、YMC-6也對大鼠離體子宮收縮幅度（最大值、最小值、平均值）和活動力呈抑制作用，但與溶劑對照組比較，YMC-4、YMC-6對收縮幅度平均值、頻率和活動力的抑制率較DMSO更明顯，但均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 YMC-4、YMC-6對正常大鼠離體子宮收縮最大值變化率的影響(±s)

表3 YMC-4、YMC-6對正常大鼠離體子宮收縮最大值變化率的影響(±s)

組別 N 給藥前 Δt（%）（g） 低劑量 中劑量 高劑量DMSO 10 3.71±1.23 3.05±3.16 5.78±5.05 21.92±24.06 YMC-6 10 4.25±1.18 2.36±3.86 0.66±27.34 14.30±11.05 YMC-4 10 4.16±0.97 3.23±18.37 15.07±22.26 13.36±24.74

表4 YMC-4、YMC-6對正常大鼠離體子宮收縮最小值變化率的影響(±s)

表4 YMC-4、YMC-6對正常大鼠離體子宮收縮最小值變化率的影響(±s)

組別 N 給藥前 Δt（%）（g） 低劑量 中劑量 高劑量DMSO 10 0.53±0.14 3.24±4.76 2.62±4.61 5.76±6.34 YMC-6 10 0.62±0.21 2.05±4.83 5.59±6.27 7.77±6.88 YMC-4 10 0.58±0.24 4.02±9.07 0.13±13.94 8.25±22.42

表5 YMC-4、YMC-6對正常大鼠離體子宮收縮平均值變化率的影響(±s)

表5 YMC-4、YMC-6對正常大鼠離體子宮收縮平均值變化率的影響(±s)

組別 N 給藥前 Δt（%）（g） 低劑量 中劑量 高劑量DMSO 10 1.24±0.31 2.88±7.52 5.45±6.05 15.34±9.31 YMC-6 10 1.68±0.62 8.97±6.62 12.30±7.68 17.39±10.21 YMC-4 10 1.63±0.72 11.66±8.57 16.88±15.43 22.33±15.78

表6 YMC-4、YMC-6對正常大鼠離體子宮收縮頻率變化率的影響(±s)

表6 YMC-4、YMC-6對正常大鼠離體子宮收縮頻率變化率的影響(±s)

組別 N 給藥前 Δt（%）（次/10 min） 低劑量 中劑量 高劑量DMSO 10 7.25±1.83 4.10±16.63 6.19±17.08 7.74±17.78 YMC-6 10 7.00±2.51 8.452±15.58 11.79±13.40 17.74±19.58 YMC-4 10 8.00±2.20 20.98±15.77 25.70±22.02 32.06±26.08

表7 YMC-4、YMC-6對正常大鼠離體子宮收縮活力變化率的影響(±s)

表7 YMC-4、YMC-6對正常大鼠離體子宮收縮活力變化率的影響(±s)

組別 N 給藥前 Δt（%）（g×s） 低劑量 中劑量 高劑量DMSO 10 8.95±3.44 6.88±17.72 11.04±19.04 22.51±13.35 YMC-6 10 12.85±9.24 16.12±17.87 22.25±15.93 31.22±22.36 YMC-4 10 13.12±6.70 29.38±18.71 37.30±23.88 47.58±23.04

由表8～表12可見，給予縮宮素后，大鼠子宮收縮明顯增強，收縮幅度（最大值、最小值、平均值）、頻率和活動力的興奮率均增大；溶劑DMSO在實驗濃度下對子宮收縮頻率呈抑制作用，對收縮幅度和活動力呈興奮作用；與DMSO比較，YMC-4明顯抑制縮宮素所致子宮收縮幅度最大值（P＜0.05），而YMC-6對收縮幅度平均值、頻率和活動力的興奮率顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表8 YMC-4、YMC-6對縮宮素致痙攣大鼠離體子宮收縮最大值變化率的影響(±s)

表8 YMC-4、YMC-6對縮宮素致痙攣大鼠離體子宮收縮最大值變化率的影響(±s)

注：與DMSO組比較，**P＜0.01

組別 N 劑量 造模前 Δt（%）（moL．L-1） （g） 造模后 給藥后DMSO 8 — 3.03±0.43 7.78±4.31 9.45±10.31 YMC-6 10 4.00×10-7 6.15±0.88 5.62±2.95 3.12±11.18 YMC-4 8 4.00×10-7 5.27±1.14 5.83±2.91 -6.41±12.86**

表9 YMC-4、YMC-6對縮宮素致痙攣正常大鼠離體子宮收縮最小值變化率的影響（±s）

表9 YMC-4、YMC-6對縮宮素致痙攣正常大鼠離體子宮收縮最小值變化率的影響（±s）

DMSO 8 — 0.79±0.25 9.61±6.98 10.47±31.56 YMC-6 10 4.00×10-7 0.58±0.16 8.06±6.65 37.78±31.24

YMC-4 8 4.00×10-7 0.58±0.13 9.86±8.11 15.11±20.92

表10 YMC-4、YMC-6對縮宮素致痙攣正常大鼠離體子宮收縮平均值變化率的影響(±s)

表10 YMC-4、YMC-6對縮宮素致痙攣正常大鼠離體子宮收縮平均值變化率的影響(±s)

注：與DMSO組比較，*P＜0.05

組別 N 劑量 造模前 Δt（%）（moL．L-1） （g） 造模后 給藥后DMSO 8 — 1.87±0.54 14.83±7.72 17.72±24.27 YMC-6 10 4.00×10-7 1.73±0.36 14.36±7.92 49.38±28.71*YMC-4 8 4.00×10-7 1.69±0.40 15.42±7.86 20.61±32.94

表11 YMC-4、YMC-6對縮宮素致痙攣正常大鼠離體子宮收縮頻率變化率的影響(±s)

表11 YMC-4、YMC-6對縮宮素致痙攣正常大鼠離體子宮收縮頻率變化率的影響(±s)

注：與DMSO組比較，*P＜0.05。

組別 N 劑量 造模前 Δt（%）（moL．L-1） （g） 造模后 給藥后DMSO 8 — 11.00±2.45 1.92±5.44 -0.16±28.72 YMC-6 10 4.00×10-7 5.90±1.66 1.82±10.79 37.71±19.41*YMC-4 8 4.00×10-7 6.90±1.52 6.44±6.91 16.54±24.67

表12 YMC-4、YMC-6對縮宮素致痙攣正常大鼠離體子宮收縮活力變化率的影響(±s)

表12 YMC-4、YMC-6對縮宮素致痙攣正常大鼠離體子宮收縮活力變化率的影響(±s)

注：與DMSO組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 N 劑量 造模前 Δt（%）（moL．L-1） （g） 造模后 給藥后DMSO 9 — 20.56±7.60 2.51±19.28 20.69±59.68 YMC-6 10 4.00×10-7 10.50±4.70 16.44±14.28 109.42±63.02**YMC-4 8 4.00×10-7 11.94±4.90 19.19±11.51* 46.28±69.93

4 討論與結論

益母草是傳統(tǒng)婦科調經中藥，以之為原料的益母草注射液則是與縮宮素聯(lián)用用以縮宮止血的中成藥[5]?，F(xiàn)代藥理研究顯示益母草對子宮活動有雙向調節(jié)作用，其中水部位和正丁醇部位是主要物質基礎[6]，而明確報道有此作用的單體化合物主要是屬生物堿類的益母草堿和水蘇堿鹽[7～9]。益母草抗血小板聚集作用的研究早在1982年已有報道，其對燙傷、冰水應激和靜脈滴注ADP所致體內血小板聚集異常均有抑制作用[10]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，益母草注射液對凝血系統(tǒng)具有雙向調節(jié)作用，其中水溶性非生物堿部分是主要的活血部位[3]，表明益母草調經活血的物質基礎不限于生物堿類。

本實驗結果顯示，YMC-6可抑制ADP誘導的血小板聚焦和延長體外凝血時間，提示其具有抗血小板聚焦和抗凝血作用，可能是益母草活血化瘀的物質基礎之一。大鼠子宮試驗中， YMC-4、YMC-6對正常離體子宮呈抑制作用趨勢，而YMC-6對縮宮素所致大鼠離體子宮痙攣可進一步提高其收縮的平均值、頻率和活動力，表現(xiàn)為與縮宮素的協(xié)同興奮作用，YMC-4則抑制縮宮素所致子宮收縮幅度最大值。以上結果表明，益母草倍半萜化合物(2S,5S)-2-hydroxy-2,6,10,10-tetramethyl-1-oxaspiro[4.5]dec-6-en-8-one是益母草活血、調經的物質基礎之一，提示益母草中存在多類化學成分以共同發(fā)揮其藥理作用，在其相關產品質量標準建立時必須考慮指標的選擇性。

參考文獻

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