假微型海鏈藻的培養(yǎng)條件研究

寧楠楠, 張 弋, 周成旭, 蔣 瑩, 陳 宇

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波 315211)

假微型海鏈藻的培養(yǎng)條件研究

寧楠楠, 張 弋, 周成旭, 蔣 瑩, 陳 宇

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波 315211)

假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及生物質(zhì)能開發(fā)。本文對浙江沿岸海區(qū)分離的一株富含中性脂的假微型海鏈藻人工培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究, 分別就光溫鹽、氮磷以及搖瓶強(qiáng)度對細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行了分析, 以期為該藻的大量培養(yǎng)提供參考。結(jié)果顯示: (1) 該藻鹽度適應(yīng)范圍廣, 培養(yǎng)在鹽度為10～45海水中, 細(xì)胞增殖率沒有顯著差異, 易于培養(yǎng)。溫度是改變該藻細(xì)胞增殖速率的主要因子, 22～25℃之間的溫差即顯著改變增殖速率, 光照與溫度的協(xié)同作用也發(fā)生改變: 25℃下, 增殖速率隨光照增加而增加, 22℃下, 光強(qiáng)差異的作用則消失。兩個溫度下,較低光照(2000 lx)利于該微藻的穩(wěn)定增殖。(2) 一次培養(yǎng)過程中, 該藻對氮的吸收比對磷的吸收迅速,指數(shù)生長期對氮吸收顯著增加; 缺氮強(qiáng)烈抑制細(xì)胞分裂和光合潛能(Fv/Fm)。當(dāng)?shù)闯渥懔紫拗泼{迫時,該藻仍有細(xì)胞分裂, 并在增殖期能維持與對照組一樣的光合潛能。(3) 適度搖瓶強(qiáng)度比完全靜置能促進(jìn)對該藻的培養(yǎng)效率, 但過度搖瓶不利于該藻細(xì)胞分裂。

假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana); 培養(yǎng)條件; 細(xì)胞增殖

以利用微藻生物質(zhì)為目標(biāo)的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中,大量培養(yǎng)一直是一個技術(shù)瓶頸。無論是開放式大池養(yǎng)殖還是光生物反應(yīng)器培養(yǎng), 獲取不同微藻的增殖最佳條件是大量培養(yǎng)的基礎(chǔ)[1-2]。對自養(yǎng)微藻進(jìn)行人工培養(yǎng)時, 首要關(guān)注的是營養(yǎng)鹽以及光照、溫度、鹽度等關(guān)鍵條件。同時, 搖瓶或充氣等條件是其中的一項重要工藝, 不同培養(yǎng)物對搖瓶或充氣等條件的需求或剪切力的耐受能力也各不相同。

假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)是中心硅藻綱的一種光合自養(yǎng)硅藻。作為模式生物, 是第一個被用來進(jìn)行全基因組測序的真核浮游硅藻[3], 之后被廣泛應(yīng)用于代謝、遺傳、毒理、生態(tài)以及能源微藻篩選等眾多領(lǐng)域的研究[4-7]。該藻還是水產(chǎn)養(yǎng)殖育苗中的一種餌料微藻[8-9]。王金娜等在進(jìn)行能源微藻篩查時, 獲得了一株分離自浙江沿海的富含中性脂的假微型海鏈藻, 具有進(jìn)行生物柴油開發(fā)利用的潛力[10]。

本研究從培養(yǎng)自養(yǎng)微藻相關(guān)的幾個關(guān)鍵因子著手, 分析了光、溫、鹽、氮、磷以及搖瓶強(qiáng)度等條件對該藻株細(xì)胞增殖的影響, 為生產(chǎn)實(shí)踐中對該藻的大量培養(yǎng)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

實(shí)驗藻種: 假微型海鏈藻(T. pseudonana, NMBguh005)為寧波大學(xué)海洋學(xué)院微藻種質(zhì)庫提供。

1.1 鹽度對假微型海鏈藻增殖的影響

對鹽度28的象山港天然海水進(jìn)行調(diào)節(jié), 加入海水精(上海保嘉生化技術(shù)有限公司)制備較高鹽度海水, 加入蒸餾水制備較低鹽度海水。實(shí)驗鹽度梯度為: 10、15、25、35、45。各組 3平行。調(diào)節(jié) pH8。實(shí)驗于 250 mL三角瓶中, 實(shí)驗水體體積 125 mL, NMB3#[11]培養(yǎng)基(除特殊說明外, 本研究均以此營養(yǎng)鹽配方)。初始細(xì)胞密度為4.7×105個/mL。置于光照 3000 lx(D∶L=12∶12), 溫度 22℃的光照培養(yǎng)箱(GXZ型智能光照培養(yǎng)箱, 寧波江南儀器廠)中培養(yǎng)。隔天取樣, 用 CASY快速細(xì)胞活力分析儀(CASY Model TT, 德國)檢測細(xì)胞密度。

1.2 光照強(qiáng)度和溫度對假微型海鏈藻增殖的影響

GXZ型智能光照培養(yǎng)箱設(shè)置光溫培養(yǎng)條件為:

預(yù)實(shí)驗中, 該藻細(xì)胞增殖的最適溫度為 22～25℃,本實(shí)驗分析溫度與光照協(xié)同對藻細(xì)胞增殖的作用。

實(shí)驗設(shè)置: 溫度: 高(H): 25℃、低(L): 22℃。光照強(qiáng)度: 高(G): 10 000 lx; 中(Z): 6 000 lx; 低(L): 2 000 lx。L∶D=12∶12。光溫組合: HG、HZ、HD、LG、LZ、LD。實(shí)驗于250 mL三角瓶中, 實(shí)驗水體體積200 mL, 初始細(xì)胞密度2.6×105個/mL。各3組平行。每天檢測細(xì)胞密度。

1.3 氮、磷元素對假微型海鏈藻細(xì)胞增殖的影響

1.3.1 一次培養(yǎng)過程中的細(xì)胞增殖及氮磷消耗

接種預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)期的藻液100 mL于300 mL新鮮培養(yǎng)液, 置于500 mL三角瓶中, 3平行。自接種日開始, 每日取5 mL藻液經(jīng)0.45 μm醋酸纖維濾膜過濾得濾液, 冷凍保存?zhèn)錅y氮磷營養(yǎng)鹽。隔日記錄細(xì)胞密度變化, 跟蹤生長周期。培養(yǎng)條件為22℃, 2 000 lx (D∶L=12∶12)。微藻培養(yǎng)結(jié)束后, 解凍濾液, 于營養(yǎng)鹽自動分析儀(Smart Chem method 100E-2)上檢測樣品的氮磷含量。

1.3.2 缺氮缺磷對細(xì)胞增殖及光合熒光參數(shù)的影響

將預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)生長期的微藻離心濃縮后, 重懸浮于缺氮、磷的人工海水[12]中進(jìn)行營養(yǎng)鹽饑餓培養(yǎng)3 d。基于NMB3#培養(yǎng)液配方, 分別制備缺磷(-P)或缺氮(-N)或 N/P=16∶1(磷的終濃度為 100 μmol/L)的人工海水培養(yǎng)液。實(shí)驗于250 mL三角瓶中, 實(shí)驗水體體積200 mL, 初始接種細(xì)胞密度為3.7×105個/mL。

光照強(qiáng)度3 000 lx(D∶L=12∶12 ), 溫度22℃,鹽度30, 各組3平行。隔天定時取樣檢測細(xì)胞密度,并檢測光合熒光參數(shù)Fv/Fm(Water-PAM, Germany)。

上述實(shí)驗均靜置培養(yǎng), 每天上下午分別定時手動搖動1次。

1.4 搖瓶強(qiáng)度對假微型海鏈藻細(xì)胞增殖的影響

以新鮮培養(yǎng)液接種指數(shù)期微藻于500 mL三角瓶中, 實(shí)驗水體體積300 mL, 初始細(xì)胞密度為1.5×105個/mL。利用水平搖床(WD-9405B, 北京六一儀器廠)不同轉(zhuǎn)速, 設(shè)置持續(xù)的“快速”(～130r/min)、“慢速”(～60r/min)、“完全靜置”3種狀態(tài)。各3組平行。置于光照5000 lx(D∶L=12∶12)、溫度25℃的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。每天檢測微藻密度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

增殖速率計算:μ=(lnNt2–lnNt1)/(t2–t1), 其中Nt1,Nt2分別為時刻t1,t2的藻細(xì)胞密度,μ為比生長速率(d-1)。

數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值, 偏差為標(biāo)準(zhǔn)偏差, 顯著性分析結(jié)果為單因素差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 鹽度對假微型海鏈藻細(xì)胞增殖的影響

圖 1為不同鹽度條件下假微型海鏈藻指數(shù)生長期的生長速率?？梢钥闯? 該藻屬廣鹽性, 雖然低鹽(10～15)條件下細(xì)胞增殖率較高鹽(45)略低(0.3 d-1～ 0.5 d-1), 但單因素顯著性差異分析顯示, 各鹽度組之間沒有顯著性差異。結(jié)果顯示, 該株近岸海域中分離的假微型海鏈藻具有廣鹽性適應(yīng)特征, 利于該藻的大規(guī)模培養(yǎng)。

圖1 不同鹽度條件下假微型海鏈藻細(xì)胞增殖速率Fig. 1 The growth rate of T. pseudonana under conditions of different salinities

2.2 光照和溫度條件對假微型海鏈藻增殖的影響

分析光溫組合條件對假微型海鏈藻的影響發(fā)現(xiàn),適宜溫度范圍內(nèi), 3℃的差異可明顯造成該藻細(xì)胞增殖顯著變化, 其差異還與光照強(qiáng)度相關(guān)(圖 2)。25℃下, 培養(yǎng)初期快速增殖, 且增殖速率隨光強(qiáng)增加而明顯增加(圖3, 4 d增長率)。但高光照下, 達(dá)最大生物量后, 細(xì)胞數(shù)量迅速下降。22℃下, 初期增長速率明顯較低, 但細(xì)胞穩(wěn)定增殖, 且高密度時可維持穩(wěn)定。該溫度下, 光強(qiáng)差異對細(xì)胞增殖的影響則不顯著(圖3)。

2.3 氮、磷元素對假微型海鏈藻細(xì)胞增殖的影響

在此一次培養(yǎng)中, 假微型海鏈藻密度穩(wěn)定增加,第7天進(jìn)入平臺期, 第2～6天為快速增殖時期。圖4中可以看出, 氮磷從起始的最高濃度降至不可檢出,其消耗時間與該藻的快速增殖期一致。而且, 每日吸收的氮磷比值在細(xì)胞快速增殖的第3～5天明顯增大,說明快速增殖時期該藻增加了對氮的吸收, 使吸收的氮磷比增加。

氮磷脅迫實(shí)驗結(jié)果(圖5)顯示, 缺氮強(qiáng)烈抑制細(xì)胞分裂, 且抑制光合作用, 光合熒光參數(shù)Fv/Fm顯著降低; 缺磷介質(zhì)中, 仍有細(xì)胞增殖, 且在實(shí)驗第7天進(jìn)入平臺期, 并可維持平臺期的密度。其Fv/Fm在培養(yǎng)初期與對照組沒有差別, 但進(jìn)入平臺期后, 較對照組顯著下降, 光合作用受到影響與細(xì)胞分裂停止同期發(fā)生。

圖2 不同光照和溫度組合條件下假微型海鏈藻細(xì)胞密度的變化Fig. 2 The population growth of T. pseudonana under synergistic effects of temperature and light

圖4 假微型海鏈藻一次培養(yǎng)中不同時期的氮磷消耗特征Fig. 4 The characteristics of the consumption of nitrogen and phosphorus during the growth phase in a batch culture of T. pseudonana

圖5 氮、磷脅迫對假微型海鏈藻細(xì)胞增殖和光合熒光參數(shù)(Fv/Fm)的影響Fig. 5 The effects of nitrogen or phosphorus starvation on the growth and chlorophyll fluorescence parameter(Fv/Fm) of T. pseudonana

2.4 搖瓶在培養(yǎng)中的作用

不同搖瓶強(qiáng)度對假微型海鏈藻的影響如圖6所示?！奥佟?～60r/min)搖瓶最利于細(xì)胞快速增殖, 接種2 d后細(xì)胞增殖率達(dá)1 d-1; 完全靜置培養(yǎng)不利于該藻細(xì)胞增殖, 5 d中增殖最少。該藻不適宜強(qiáng)烈搖瓶(～130 r/min), 細(xì)胞增殖率不高, 并且微藻出現(xiàn)聚團(tuán)。

圖6 搖瓶強(qiáng)度對假微型海鏈藻細(xì)胞增殖的影響Fig. 6 The effect of shaking on the growth of T. pseudonana

3 討論

培養(yǎng)海洋微藻最重要的條件因子是光照、溫度、鹽度以及營養(yǎng)鹽。假微型海鏈藻是廣分布型, 沿海和大洋均有分布[13]。其生物發(fā)生可能是由淡水小環(huán)藻演化而來[14]。從本研究結(jié)果來看, 該藻適宜鹽度的范圍廣, 細(xì)胞增殖速率在鹽度10～45中沒有顯著差異,易于各鹽度中培養(yǎng)。該藻對溫度變化敏感, 適溫范圍內(nèi), 3℃溫差顯著改變細(xì)胞增殖率。光照強(qiáng)度的作用差異也因3℃溫差而不同: 較高溫度下, 光照越強(qiáng)細(xì)胞分裂越快; 較低溫度下增殖速率則不因光強(qiáng)而變化, 顯示了光溫的協(xié)同作用。Halac等[15]的研究表明,在光輻射增強(qiáng)的情況下, 培養(yǎng)溫度升高有利于保護(hù)假微型海鏈藻光合作用中心, 提高微藻抵抗輻射損傷的能力, 也說明了光輻射與溫度的協(xié)同影響。Brand等[13]的研究表明, 假微型海鏈藻細(xì)胞增殖率與溫度正相關(guān), 且沿海品系和大洋品系細(xì)胞分裂速率隨溫度變化效應(yīng)是相同的。早期關(guān)于假微型海鏈藻的培養(yǎng)條件研究也表明, 假微型海鏈藻生長率首先與溫度密切相關(guān), 但同時受光照強(qiáng)度以及光周期調(diào)節(jié)[8]。細(xì)胞生活史中, 該藻可進(jìn)入休眠期, 此過程中,光合作用以及構(gòu)成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)用的極性脂累積, 為其在環(huán)境條件適宜時提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[4], 形成了假微型海鏈藻分布廣、生長率高的特征。這些特點(diǎn)使該藻易于人工培養(yǎng)。需要重點(diǎn)關(guān)注的是, 精確的光溫優(yōu)化組合以及添加營養(yǎng)鹽的時機(jī), 是獲得快速高生物量增殖的關(guān)鍵, 尤其在光生物反應(yīng)器設(shè)計和應(yīng)用中, 需要將光、溫同時考慮。

本研究結(jié)果顯示, 該藻對氮的吸收速率高, 氮脅迫強(qiáng)烈抑制細(xì)胞分裂和光合作用。細(xì)胞對磷的吸收速率相對緩慢, 且細(xì)胞能耐受外界的磷脅迫?？笛嘤竦萚16]研究表明, 假微型海鏈藻最佳生長的 N/P = 16。本研究中, 快速初期增殖后密度的迅速下降, 可能是因無機(jī)氮源被快速增殖消耗后形成的氮脅迫造成。因此, 還需要進(jìn)一步分析不同光溫條件下的營養(yǎng)鹽吸收特征, 從而為高效的連續(xù)培養(yǎng)工藝提供參數(shù)。磷限制條件下, 假微型海鏈藻可進(jìn)行多種代謝調(diào)節(jié)以抵抗磷脅迫, 例如增加磷的轉(zhuǎn)運(yùn)、生成多磷酸鹽以及堿性磷酸酶的活性表達(dá)以利用有機(jī)磷等[17], 這些能力可能使該藻在磷限制的情況下也能進(jìn)行細(xì)胞分裂實(shí)現(xiàn)增殖。

自然環(huán)境中, 微藻不同, 對擾動的需求和耐受能力不同, 其適應(yīng)特征對人工培養(yǎng)微藻的工藝具有指導(dǎo)意義[18]。本研究結(jié)果顯示, 完全靜置培養(yǎng)不利于該藻的細(xì)胞增殖, 但是過度搖瓶也會干擾細(xì)胞分裂。尤其在設(shè)計該藻的光生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)時, 實(shí)際的搖動強(qiáng)度還需要綜合多種培養(yǎng)條件進(jìn)行分析。

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(本文編輯: 梁德海)

The study of the culture conditions ofThalassiosira pseudonana

NING Nan-nan, ZHANG Yi, ZHOU Cheng-xu, JIANG Ying, CHEN Yu
(Marine institute of Ningbo University, Ningbo 315211, China)

May, 31, 2013

Thalassiosira pseudonana; culture conditions;cell division

Thalassiosira pseudonanais an important microalgal species in the basic research as model organism, and widely applied in the development as aquaculture feed and biofuel. In the present study, the culture conditions for one strain of oil-richT. pseudonanaisolated from Zhejiang coastal area was analyzed. The cultivation factors included temperature, light intensity, salinity, nitrogen, phosphate, and shaking. The results indicated that: (1) there was no significant difference in growth rate when the strain ofT. pseudonanawas cultured in medium with different salinity ranging from 10‰ to 45‰. However, the species is sensitive to temperature. Even with minor temperature changes between 22 ℃ and 25℃, the growth rate varied significantly. High light intensity (10000lx) together with higher temperature (25℃) could stimulate rapid population growth. At 22℃, growth rate was not affected by the light intensity; (2) this species could absorb nitrogen more rapidly than phosphate, especially in the exponential growth phase. Lack of nitrogen inhibited the cell division and photosynthesis capacity (Fv/Fm). However, such phenomena did not exhibit very obviously for the lack of phosphate; (3) the perturbation, at moderate extent, was better than suspending culture.

S968.4

A

1000-3096(2014)01-0052-05

10.11759/hykx20130129007

2013-05-31;

2013-07-09

海洋可再生能源專項資金項目(GHME2001SW02); 國家公益性行業(yè)(海洋)科研專項經(jīng)費(fèi)項目(201105009); 浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(2011R405028)

寧楠楠(1992-), 女, 浙江衢州人, 本科生, 研究方向為海洋生物學(xué), E-mail:nnn1551@163.com; 周成旭, 通信作者, 副研究員, 主要從事海洋微藻基礎(chǔ)研究與應(yīng)用研究, E-mail: zhouchengxu@nbu.edu.cn