柱前衍生化反相高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿中?；撬岬暮考捌渌巹?dòng)學(xué)研究

岳山嵐，王 維，帥淑平，王 靜，王吉琳，趙一凡，楊俊毅

（四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041）

柱前衍生化反相高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿中?；撬岬暮考捌渌巹?dòng)學(xué)研究

岳山嵐，王 維，帥淑平，王 靜，王吉琳，趙一凡，楊俊毅

（四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041）

建立一種測(cè)定大鼠血漿中牛磺酸含量的柱前衍生化-高效液相色譜法，并將其應(yīng)用于?；撬嵩诖笫篌w內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。采用柱前衍生化高效液相色譜法，以2，4-二硝基氟苯（DNFB）為衍生化試劑，以KH2PO3緩沖液（pH 7.0）：乙腈∶水（70∶15∶15，v/v）為流動(dòng)相，經(jīng)C18色譜柱（250mm×4.6mm×5μm）分離，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL，牛磺酸衍生物的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm，并以DAS2.0計(jì)算其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。大鼠血漿中?；撬嵩?.29～1 287.5 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 9，最低定量限1.29 μg/mL，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t1/2為（3.747±1.430）h，Cmax為（949.573±192.967）μg/mL，Tmax為（1.000±0.000）h，AUC0-t為（2862.168±565.917）（mg/L）/h。該法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、靈敏，適用于?；撬嵫帩舛葴y(cè)定及藥動(dòng)學(xué)研究。

?；撬?；高效液相色譜法；柱前衍生化；藥動(dòng)學(xué)

0 引 言

?；撬幔╰aurine）又名牛膽堿、牛膽素，是存在于人及動(dòng)物體內(nèi)的一種非蛋白游離氨基酸[1]。牛磺酸具有廣泛的生理藥理作用[2-3]，臨床上用于治療支氣管炎，急慢性肝炎，高血壓等疾病，大多為口服制劑[4]。?；撬岜旧頉]有紫外吸收，因此無法使用常規(guī)的高效液相色譜法（HPLC）對(duì)其濃度進(jìn)行檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中關(guān)于牛磺酸濃度的測(cè)定方法主要有氨基酸自動(dòng)分析儀法[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS）[6]、柱后衍生化法[7]、柱前衍生化法[8]、薄層掃描法[9]等。其中，LCMS法、柱后衍生化法、氨基酸自動(dòng)分析儀法存在對(duì)檢測(cè)儀器要求較高，且檢測(cè)費(fèi)用昂貴，不適用于大批量樣品檢測(cè)分析的缺陷；而薄層掃描法在操作過程中影響因素太多。柱前衍生化為將樣品在進(jìn)樣前進(jìn)行衍生化反應(yīng)，可以相對(duì)自由地選擇反應(yīng)條件，不存在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的限制；衍生化的副產(chǎn)物可進(jìn)行預(yù)處理以降低或消除其干擾；允許多步反應(yīng)的進(jìn)行，有較多的衍生化試劑可選擇。2，4-二硝基氟苯（DNFB）作為一種衍生化試劑，與牛磺酸在堿性條件下發(fā)生衍生化反應(yīng)：

生成的?；撬嵫苌锞哂凶贤馕?，可用于檢測(cè)分析。本研究旨在建立一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)且具有足夠靈敏度的柱前衍生化-高效液相色譜法，以測(cè)定生物樣品中?；撬岬臐舛龋?yīng)用于?；撬岬呐R床前藥動(dòng)學(xué)研究。

1 材 料

1）儀器。LC-10AT高效液相-泵（SHIMAZU，日本）；CTO-10Asvp高效液相-柱溫箱（SHIMAZU，日本）；B-220恒溫水浴鍋（上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司）；ZP-200振蕩器（江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；TGL-16高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SIMENS低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）；AUW 120D電子天平（SHIMAZU，日本）；DW-FL 270低溫冰箱（中科美菱）。

2）藥物和試劑。牛磺酸（潛江永安藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20110424，純度：99%）；?；撬釋?duì)照品（純度＞99%，Sigma公司）；2，4-二硝基氟苯（DNFB）（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、碳酸氫鈉為分析純；乙腈為色譜純，水為超純水。

3）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。健康SD大鼠，雌雄各半，四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（川）2009-09。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱（250mm×4.6mm×5μm），流動(dòng)相為KH2PO3緩沖液（pH 7.0）∶乙腈∶水（70∶15∶15，v/v），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，進(jìn)樣量20μL。

2.2 牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取?；撬釋?duì)照品約1g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加純水溶解并稀釋至刻度，混勻，得質(zhì)量濃度為0.010 3 g/mL的?；撬醿?chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液適量，用水稀釋，得質(zhì)量濃度分別為2.575，5.15，25.75，103，257.5，1030，2060，2575μg/mL的?；撬嵯盗袠?biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 血漿的制備

取SD大鼠5只，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，按0.9g/kg劑量單次口服灌胃牛磺酸，在給藥過程中保證SD大鼠服藥完全，分別于給藥前和給藥后0.033，0.083，0.25，0.5，1，2，3，5，7，9，12，24h尾靜脈采血0.5 mL，血樣置肝素化采血管中，8 000 r/min離心5min，分離血漿，于-40℃冰箱儲(chǔ)存待測(cè)。

2.4 血漿樣品的處理

取200μL血漿樣品，加純水100 μL，渦旋混合30 s，加乙腈500 μL，渦旋3 min，12 000 r/min離心5min，取上清液500μL于5mL容量瓶中，加NaHCO3溶液（0.5 mol/L，pH9.0）500 μL，再加入1.0%（v/v）的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液100μL，避光80℃水浴加熱1h，取出，用KH2PO3緩沖液（pH7.0）稀釋至刻度，取20μL進(jìn)樣。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 方法的專屬性

在本實(shí)驗(yàn)所采用的HPLC條件下，2，4-二硝基氟苯的出峰時(shí)間在7.6 min，?；撬嵫苌锏某龇鍟r(shí)間在13.5 min，峰形良好，與衍生化試劑分離良好，空白血漿樣品無明顯內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾測(cè)定；本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中的?；撬岬馁|(zhì)量濃度，靈敏度較高，如圖1所示。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取空白SD大鼠血漿200μL，置于1.5mL離心管中，分別加2.2的?；撬嵯盗袠?biāo)準(zhǔn)溶液100μL，得到?；撬豳|(zhì)量濃度分別為1.29，2.58，12.88，51.5，128.75，515，1030，1287.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，除不加純水100μL外，其余按2.4方法操作，記錄色譜圖。計(jì)算?；撬嵫苌锓迕娣eATau和空白血漿中?；撬嵫苌锓迕娣eAKB的差值y，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，以y值對(duì)血藥濃度C作加權(quán)直線回歸計(jì)算，得線性回歸方程y=2 218.381×C+7 653.674，r=0.9999，在1.29～1287.5μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖2。

圖1 ?；撬嵫苌锱c衍生化試劑色譜圖

圖2 ?；撬嵫獫{樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.3 定量下線的確定

取空白血漿200 μL，制備含?；撬豳|(zhì)量濃度為1.29 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品（n=5），除不加純水100μL外，其余按2.4方法操作。記錄色譜圖，計(jì)算?；撬嵫苌锓迕娣eATau和空白血漿中?；撬嵫苌锓迕娣eAKB的差值y，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，得其回收率為108.38%±7.24%。按上述條件測(cè)得?；撬嵩谘獫{中的定量下限為1.29μg/mL。

2.5.4 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

取空白血漿200μL，制備低、中、高濃度分別為2.58，128.75，1 030 μg/mL的含藥血漿樣品（n=5），除不加純水100μL外，其余按2.4方法操作。連續(xù)制備3個(gè)分析樣品，記錄色譜圖，計(jì)算?；撬嵫苌锓迕娣eATau和空白血漿中?；撬嵫苌锓迕娣eAKB的差值y，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度及準(zhǔn)確度、批內(nèi)和批間精密度。結(jié)果低、中、高3種濃度樣品回收率在98.45%～109.27%之間，批內(nèi)及批間RSD均≤5.0%。

2.5.5 樣品穩(wěn)定性考察

取空白血漿200μL，制備濃度分別為2.58，128.75， 1030μg/mL的含藥血漿樣品（n=5），按2.4方法操作后，室溫放置0，10，24h后再測(cè)定，記錄樣品峰面積，計(jì)算實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，并與0h測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，?；撬嵫獫{樣品在處理后室溫放置至少能穩(wěn)定24h。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

取SD大鼠5只，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，按0.9g/kg劑量單次口服灌胃給予?；撬?，在給藥過程中保證SD大鼠服藥完全，分別于給藥前和給藥后0.033，0.083，0.25，0.5，1，2，3，5，7，9，12和24 h尾靜脈采血0.5 mL，血樣置肝素化采血管中，8000r/min離心5min，分離血漿，于-40℃冰箱儲(chǔ)存。按2.4方法操作后，在本實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制?；撬岬钠骄帩舛?時(shí)間曲線，見圖3。

圖3 牛磺酸平均血藥濃度-時(shí)間曲線

采用藥動(dòng)學(xué)軟件DAS 2.0計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，根據(jù)二室模型依賴性參數(shù)估算方法，計(jì)算SD大鼠口服牛磺酸后的藥動(dòng)學(xué)主要參數(shù)，AUC0-t為（2862.168± 565.917）（mg/L）/h，Cmax為（949.573±192.967）μg/mL，Tmax為（1.000±0.000）h，t1/2為（3.747±1.430）h，結(jié)果見表1。

表1 牛磺酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討 論

?；撬岜旧頉]有紫外吸收，須經(jīng)衍生化后方能通過紫外檢測(cè)進(jìn)行含量測(cè)定。因此衍生化試劑的選擇尤其重要，常用的衍生化試劑有鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA），丹磺酰氯（dansylchloride）和2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzen，DNFB）等，用鄰苯二甲醛配制的OPA試液可使?；撬嵩诙虝r(shí)間內(nèi)衍生化，但衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性差，要求檢測(cè)迅速，故更適用于柱后衍生化檢測(cè)，且因其不穩(wěn)定性對(duì)操作要求較高。而丹磺酰氯做衍生試劑易產(chǎn)生副產(chǎn)物，干擾測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)選用DNFB作為衍生化試劑，以桑格反應(yīng)（Sanger reaction）為基礎(chǔ)，在弱堿性，避光，80℃條件下，DNFB與?；撬岬摩?氨基發(fā)生反應(yīng)，生成黃色的2，4-二硝基苯?；撬?，這種衍生化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易水解，且過量的DNFB的色譜峰對(duì)?；撬岷繙y(cè)定無干擾，衍生化及HPLC檢測(cè)過程操作簡(jiǎn)單，快速，重現(xiàn)性好；另本方法的定量下限為1.29μg/mL，小于最新報(bào)道的使用相同衍生化方法后檢測(cè)所得的定量下限值3.00μg/mL[10]。且與報(bào)道中的梯度洗脫法相比，在兩法均能使?；撬嵫苌锱c其他物質(zhì)有效分離的前提下，本方法中使用的等度洗脫具有重現(xiàn)性好、精密度高的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于?；撬嵘飿颖镜姆治?。

本研究考察了衍生化試劑（DNFB）的用量（100，200μL）、衍生化反應(yīng)時(shí)間（35，40，45，50，55，60min）及反應(yīng)溫度（60，70，80℃）。結(jié)果表明當(dāng)衍生化試劑（DNFB）用量為100μL，在避光條件下80℃反應(yīng)1h后衍生化效率最高。在此條件下，DNFB與牛磺酸生成的衍生物室溫下放置24h仍然穩(wěn)定。

4 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)選用2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzen，DNFB）作衍生化試劑建立的柱前衍生化-高效液相色譜法操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)成本低，重復(fù)性好，可成功地用于大鼠血漿中?；撬岬暮繙y(cè)定。將其應(yīng)用于?；撬嵩诖笫篌w內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究后得到的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax為（949.573±192.967）μg/mL，Tmax為（1.000±0.000）h，t1/2為（3.747±1.430）h，AUC0-t為（2862.168±565.917）（mg/L）/h。本研究結(jié)果可為牛磺酸的進(jìn)一步藥動(dòng)學(xué)研究提供參考。

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Determination of taurine in rat plasma by RP-HPLC with pre-column derivatization and its pharmacokinetic study

YUE Shan-lan，WANG Wei，SHUAI Shu-ping，WANG Jing，WANG Ji-lin，ZHAO Yi-fan，YANG Jun-yi
（School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

To develop a HPLC method with pre-column derivatization for the determination of taurine in rat plasma and its application to the pharmacokinetic study after oral administration of taurine.The concentration of taurine in plasma was determined by a HPLC method with precolumn derivatization，and 2，4-dinitrofluorobenzene（DNFB）was used as a derivatization reagent. Chromatographic separation was performed on an C18 column（250 mm×4.6 mm×5μm），the mobile phase was consisted of KH2PO3buffer solution∶acetonitrile∶water（70∶15∶15，v/v）at a flow rate of 1.0 mL/min，the column temperature was at 30℃ and injection volume was 20 μL.The taurine derivative wasdetected by measuring the UV absorbance at360 nm.The pharmacokinetic parameters were calculated with the DAS2.0 software.Results:the calibration curve of taurine was linear（r=0.999 9）in the range of 1.29～1287.5 μg/mL.The limit of quantitation was 1.29 μg/mL，and the key pharmacokinetic parameters were t1/2（3.747±1.430）h，Cmax（949.573±192.967）μg/mL，Tmax（1.000±0.000）h，AUC0-t（2 862.168±565.917）（mg/L）/h.The method is simple，economic and sensitive，which can be successfully applied for the determination of taurine in plasma and its pharmacokinetic studies in rats.

taurine；HPLC；pre-column derivatization；pharmacokinetics

R914；TQ460.7+2；O657.7+2；O623.84

：A

：1674-5124（2014)06-0056-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.06.015

2013-12-01；

：2014-01-24

岳山嵐（1988-），女，四川閬中市人，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)榕R床用藥的藥動(dòng)學(xué)基礎(chǔ)研究。