細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療中晚期泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤效果觀察

李 霞，趙穩(wěn)興，蔡 琳，蔡學(xué)敏，崔 靜，王媛媛，徐文漭

泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤由于病程發(fā)展較快，患者就診時(shí)已屬中晚期。過繼免疫治療是繼手術(shù)、放療、化療之外治療腫瘤的方法。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells，CIK)在體外可大量擴(kuò)增，有較強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)，CIK治療是有效的過繼免疫療法之一［1-2］。成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院2005年6月—2010年2月為38例中晚期泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤進(jìn)行了CIK治療，效果滿意，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):①Karnofsky評(píng)分［3］≥60分;②心、肝、腎功能及血常規(guī)大致正常，白細(xì)胞數(shù)＞2.1×109;③接受CIK治療前均未接受其他免疫治療或免疫抑制治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①正在接受放、化療或其他全身抗腫瘤治療者;②合并傳染性疾病者;③對(duì)生物制品過敏反應(yīng)者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署治療知情同意書。

1.2 一般資料 本組38例，男25例，女13例;年齡28～75歲。均經(jīng)影像學(xué)及病理學(xué)等確診為惡性腫瘤，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期標(biāo)準(zhǔn)［4］進(jìn)行臨床分期:Ⅱ期4例，占10.5%;Ⅲ ～Ⅳ期34例，占89.5%;膀胱癌4例，前列腺癌9例，腎癌12例，宮頸癌3例，子宮內(nèi)膜癌5例，卵巢癌5例?；颊呔鶅H接受手術(shù)治療，因各種原因自動(dòng)放棄放、化療。

1.3 治療方法

1.3.1 CIK制備:手術(shù)后2周用Pules-3000血細(xì)胞分離機(jī)(美國百特公司)采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，再采用淋巴細(xì)胞分離液(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)進(jìn)一步分離純化 PMBC，用AIM-V培養(yǎng)基(GIBCO公司)調(diào)整細(xì)胞密度為(1～2)×106個(gè)/ml細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(Therm公司)。0 h培養(yǎng)加1000 U/mlγ干擾素(γ-IFN)(上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司)，24 h后加1000 U/ml白介素(IL)-2(山東泉港藥業(yè)有限公司)、50 ng/ml CD3單克隆抗體(CD3 McAb)(美國BD公司)繼續(xù)培養(yǎng)。4～5 d細(xì)胞傳代培養(yǎng)用僅含1000 U/ml IL-2的AIM-V培養(yǎng)基維持。每日用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.3.2 CIK回輸:細(xì)胞培養(yǎng)7～10 d經(jīng)微生物檢測(cè)陰性、活性檢測(cè)＞80%時(shí)收集部分細(xì)胞，先用生理鹽水50 ml洗滌細(xì)胞2次，然后懸于200 ml生理鹽水中通過靜脈回輸，連續(xù)3 d為1個(gè)療程。輸注前、后均用生理鹽水沖管，避免與其他藥物混合，嚴(yán)格控制滴速，先慢后快。每次回輸細(xì)胞數(shù)＞1×109，每療程細(xì)胞數(shù)(5～10)×109。3個(gè)月重復(fù)1次治療。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 收集培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞，0.9%氯化鈉溶液洗滌2次，再用PBS液洗滌2次后懸浮細(xì)胞涂片，細(xì)胞數(shù)量約1×107。應(yīng)用EnvisionTM二步法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 分別于治療前、第2療程結(jié)束通過流式細(xì)胞儀(BD公司)檢測(cè)外周靜脈血CD56+、CD3+、CD3+CD56+T細(xì)胞。均于清晨空腹采集患者2 ml靜脈血，EDTA抗凝。取不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體各20μl，分別加入100μl抗凝外周血中，室溫下孵育15 min后加入紅細(xì)胞裂解液，PBS液洗滌2次后檢測(cè)，應(yīng)用Cellquest軟件分析數(shù)據(jù)，記錄陽性細(xì)胞百分率。

1.6 觀測(cè)指標(biāo)及療效判定 觀測(cè)指標(biāo)包括瘤體變化、腫瘤標(biāo)志物、生存期、生存質(zhì)量及毒性反應(yīng)等。療效參照WHO對(duì)實(shí)體瘤療效判定標(biāo)準(zhǔn)［4］進(jìn)行評(píng)價(jià):以患者治療前及完成2個(gè)療程治療后CT及B超結(jié)果進(jìn)行對(duì)照比較，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、輕度緩解(MR)、穩(wěn)定(SD)、進(jìn)展(PD)，緩解率(%)=(CR+PR+MR)例數(shù)/總例數(shù)×100%。同時(shí)評(píng)估臨床癥狀，復(fù)查胸部CT、血常規(guī)、肝腎功能等;臨床癥狀、生存質(zhì)量及毒性反應(yīng)以患者主訴為依據(jù)，其中生存質(zhì)量采用 Karnofsky評(píng)分評(píng)價(jià)［5］，提高＞10分為改善，下降＞10分為惡化，提高或下降≤10分為穩(wěn)定，Karnofsky評(píng)分總提高率(%)=(改善+穩(wěn)定)例數(shù)/總例數(shù)×%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞表面標(biāo)記 免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)7 d的CIK CD3和CD56呈強(qiáng)陽性，見圖1。

圖1 培養(yǎng)7 d后的CIKCIK.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞;A.CIK體積較大，核圓形，胞漿豐富(HE×200);B.CIK細(xì)胞膜CD3染色陽性(DAB×200);C.CIK細(xì)胞膜CD56染色陽性(DAB×200)

2.2 機(jī)體免疫狀態(tài)變化 CIK細(xì)胞回輸后監(jiān)測(cè)血常規(guī)、腎功能、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)未見異常;第2療程后患者外周血免疫指標(biāo)較治療前明顯改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖 2、表 1。

圖2 38例中晚期泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤患者細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療前后流式細(xì)胞檢測(cè)圖

表1 38例中晚期泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤患者CIK治療前后機(jī)體免疫狀態(tài)變化(x ± s，%)

2.3 臨床療效及毒性反應(yīng) 本組4例接受6個(gè)療程、10例接受4個(gè)療程 、15例接受3個(gè)療程 、9例接受2個(gè)療程治療。2個(gè)療程后，CR 20例，PR 11例，MR 5例，SD 2例，緩解率為94.7%。復(fù)查胸部CT均未見異常。本組均獲隨訪，隨訪時(shí)間2～8年，存活5年以上者17例，其中前列腺癌8例，腎癌9例。本組僅1例女性腎癌患者回輸CIK時(shí)出現(xiàn)發(fā)熱，經(jīng)對(duì)癥處理后體溫恢復(fù)正常。

2.4 腫瘤標(biāo)志物變化 與治療前比較，治療2個(gè)療程后癌胚抗原(CEA)、癌抗原(CA)125、乳酸脫氫酶(LDH)及前列腺特異性抗原(PSA)水平均顯著下降(P ＜0.01)，見表2。

表2 38例中晚期泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤患者CIK治療前后腫瘤標(biāo)志物變化(x±s)

2.5 生存質(zhì)量變化 本組治療后Karnofsky評(píng)分提高10～20分，其中改善34例，穩(wěn)定2例，Karnofsky評(píng)分提高率為94.7%。治療后患者體質(zhì)量平均增加1～2 kg。2年無病生存21例，無病生存率(disease free survival，DFS)為55.3%，5年無病生存17例，DFS為44.7%。

3 討論

3.1 CIK作用機(jī)制 腫瘤生物治療主要有細(xì)胞因子治療、單克隆抗體治療、基因治療、過繼細(xì)胞免疫治療和腫瘤疫苗治療5類［6-9］。CIK治療被認(rèn)為是具有較好應(yīng)用前景的過繼細(xì)胞免疫治療方法［10-11］。CIK是存在于人體外周血中的，經(jīng)抗CD3McAb、γ-IFN、IL-2等聯(lián)合作用后產(chǎn)生的一類對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞具有高度殺傷能力的T淋巴細(xì)胞［12］，兼具T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和自然殺傷細(xì)胞(NK)非組織相容性抗原(MHC)限制性殺瘤細(xì)胞特性，且增殖能力強(qiáng)，同時(shí)還能分泌 IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)等細(xì)胞因子，增強(qiáng)細(xì)胞毒作用，或調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞的敏感性，間接殺傷腫瘤細(xì)胞［13］。體內(nèi)回輸CIK可在不損傷機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的前提下直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。此外，CIK還是對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞敏感的廣譜抗瘤免疫活性細(xì)胞［14］。因此，CIK免疫治療因低毒、有效的特點(diǎn)越來越受到重視［15-18］。

3.2 泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的治療現(xiàn)狀 女性器官位于盆腔深部，由于位置特殊，婦科惡性腫瘤目前缺少有效的診斷方法，患者出現(xiàn)癥狀時(shí)往往已是中晚期，喪失徹底切除腫瘤的機(jī)會(huì)。婦科惡性腫瘤治療仍以放化療及手術(shù)為基本手段，但腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)直接影響患者的預(yù)后。卵巢癌雖然對(duì)化療敏感，但由于化療毒性作用較大，很多患者無法耐受全程化療。放療與腔內(nèi)照射+化療為局部晚期宮頸癌標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方案，但急性不良反應(yīng)較嚴(yán)重，能最終完成治療的患者不足50%［19］。前列腺癌及泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率約占實(shí)體瘤的9%，且近年來有不斷上升的趨勢(shì)。將近一半的患者首次就診時(shí)已屬晚期或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，約50%的患者術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，未接受治療者3年存活率低于5%。腎癌是免疫原性較強(qiáng)的腫瘤之一，轉(zhuǎn)移性腎癌預(yù)后極差，化療作用有限，總反應(yīng)率僅為5% ～15%［20］，但對(duì)生物免疫治療比較敏感，以往采用細(xì)胞因子類藥物治療，有研究將CIK用于治療局限性腎癌、轉(zhuǎn)移性腎癌，取得了較好的臨床效果［21-22］。對(duì)于中晚期前列腺癌，放、化療及內(nèi)分泌治療雖有一定效果，但毒性反應(yīng)較大，易復(fù)發(fā)，細(xì)胞過繼免疫治療有較好效果［23］。

3.3 CIK治療注意事項(xiàng) CIK治療作為一種新的生物治療方法，在給腫瘤患者帶來希望的同時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致患者及其家屬產(chǎn)生疑惑、恐懼心理［24-26］。治療前應(yīng)盡可能與患者及其家屬多溝通交流，客觀介紹CIK治療的效果及可能發(fā)生的毒性反應(yīng)，可介紹治療成功的患者，消除患者及其家屬的疑惑、恐懼心理，使其全力配合治療。同時(shí)向患者及家屬講明該方法療效存在個(gè)體差異，幫助患者調(diào)整好心態(tài)，避免因達(dá)不到預(yù)期療效而出現(xiàn)心理落差。細(xì)胞輸注過程中除嚴(yán)格按照輸血程序無菌操作外，還要嚴(yán)密觀察生命體征，對(duì)心肺功能不全者滴速應(yīng)盡量緩慢，輸入液體量應(yīng)嚴(yán)格限制?；剌敽蠡颊咦畛Ｒ姷亩拘苑磻?yīng)是發(fā)熱，可能是腫瘤熱或CIK攻擊腫瘤所致，本組僅出現(xiàn)1例，經(jīng)對(duì)癥處理后體溫恢復(fù)正常。

綜上所述，放、化療后間隔2～4周、機(jī)體免疫力有所恢復(fù)時(shí)輸入CIK，可提高泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤患者的緩解率。本組行手術(shù)后結(jié)合CIK治療，2個(gè)療程后緩解率為94.7%，相關(guān)腫瘤標(biāo)志物呈下降趨勢(shì)，而相關(guān)免疫活性細(xì)胞呈上升趨勢(shì)，Karnofsky評(píng)分提高10～20分，體質(zhì)量增加1～2 kg。表明CIK療法是治療中晚期泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的有效方法。

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