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    紅景天苷對(duì)力竭大鼠心肌線粒體生物發(fā)生關(guān)鍵調(diào)控因子的影響

    2014-03-06 06:01:22崔玉娟張龍飛曹雪濱
    解放軍醫(yī)藥雜志 2014年11期
    關(guān)鍵詞:力竭紅景天線粒體

    崔玉娟,張龍飛,平 政,曹雪濱

    線粒體是真核細(xì)胞進(jìn)行氧化代謝產(chǎn)生能量的場(chǎng)所,對(duì)心肌收縮功能的維持起著至關(guān)重要的作用。冷暴露、饑餓、運(yùn)動(dòng)等刺激會(huì)誘導(dǎo)線粒體數(shù)量增加和功能改變,即線粒體生物發(fā)生[1]。線粒體生物發(fā)生能夠提高細(xì)胞的能量代謝能力,從而滿足心肌持續(xù)收縮所需能量。目前研究表明線粒體生物發(fā)生的主導(dǎo)協(xié)調(diào)因子——過氧化物酶增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator 1α,PGC-1α)在線粒體活動(dòng)中發(fā)揮了中心作用,它是控制線粒體生物發(fā)生轉(zhuǎn)錄通路上游的調(diào)節(jié)共激活因子,能通過強(qiáng)烈地誘導(dǎo)核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor-1,NRF-1)和核呼吸因子-2(nuclear respiratory factor-2,NRF-2)基因的表達(dá)刺激線粒體生物合成,因此,PGC-1α-NRF-1-NRF-2是調(diào)控線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵級(jí)聯(lián)信號(hào)通路[2]。運(yùn)動(dòng)是一種病理生理刺激,適度運(yùn)動(dòng)能夠誘導(dǎo) PGC-1α、NRF-1、NRF-2 的表達(dá)[3],從而刺激線粒體生物發(fā)生。而力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)對(duì)機(jī)體心臟功能造成負(fù)面影響,引起線粒體功能障礙[4],但其分子機(jī)制是否與線粒體生物發(fā)生有關(guān)尚不明確。紅景天苷(Salidroside,SAL)是中藥紅景天中的主要有效成分之一,具有抗心肌缺血缺氧、抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管再生、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究SAL對(duì)力竭大鼠心肌線粒體生物發(fā)生關(guān)鍵調(diào)控因子 PGC-1α、NRF-1、NRF-2在不同時(shí)相的表達(dá),為SAL的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 清潔級(jí)SD雄性大鼠104只[軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(京)2003-1-003]。98%提純紅景天苷粉(南京澤朗植提技術(shù)有限公司),兔抗PGC-1α抗體、兔抗NRF-1抗體及兔抗NRF-2抗體(英國(guó)Abcam公司),兔抗β-Actin抗體(美國(guó)CST公司),HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(中國(guó)中杉金橋公司)。凝膠成像系統(tǒng) Fluor Chem E(美國(guó) Cell Biosciences公司)。Image J 1.44圖像分析軟件(National Institutes of Health)。

    1.2 方法

    1.2.1 分組:將104只SD大鼠隨機(jī)分對(duì)照(C)組、力竭(EE)組、低劑量SAL力竭(LS)組、高劑量SAL力竭(HS)組,對(duì)照組8只,其余組分4個(gè)時(shí)間點(diǎn)即即刻、6 h、12 h、24 h 觀察,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8 只。

    1.2.2 造模及取材:C及EE組給予生理鹽水10 ml/kg灌胃 2周,LS和 HS組給予 SAL 100、300 mg/kg灌胃2周。EE、LS和HS組灌胃結(jié)束后分別予以建立一次性力竭游泳模型,C組無需特殊處理。一次性力竭游泳模型建立方法:使用塑料圓桶(高60 cm、直徑55 cm)作為大鼠的游泳場(chǎng)地,注意保證水的清潔,水深約 50 cm,水溫保持在(32.0±0.5)℃。模型建立前大鼠均進(jìn)行適應(yīng)性的無負(fù)重游泳練習(xí),每次10 min,造模前大鼠需禁食12 h,造模時(shí)大鼠尾部負(fù)為體重3%的鉛塊。一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)所達(dá)到的力竭狀態(tài)參考Thomas力竭標(biāo)準(zhǔn)[8]:①大鼠超過10 s沉入水下后無法再返回水面;②大鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)消失,出現(xiàn)了無方向性的亂竄,雖少于10 s亦可定為大鼠已力竭。對(duì)于短時(shí)間(2 h)內(nèi)就出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)的大鼠,將其撈出休息5 min后,繼續(xù)進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)至其力竭。達(dá)到力竭標(biāo)準(zhǔn)后,將大鼠撈出,吹干皮毛,并記錄結(jié)束時(shí)間。力竭后即刻、6、12、24 h,立即摘除3個(gè)模型組大鼠心臟,去除心房,于緩沖液中洗去心臟殘留血漬,裝入2 ml離心管中,做好標(biāo)記,置于液氮中冷凍后于-80℃冰箱中保存。同時(shí)期相同方法處理 C組大鼠。

    1.3 觀察指標(biāo)

    1.3.1 大鼠一般狀況及游泳時(shí)間:觀察3個(gè)模型組力竭運(yùn)動(dòng)前后的一般狀況,記錄并比較EE、LS、HS組力竭游泳時(shí)間。

    1.3.2 大鼠心肌 PGC-1α、NRF-1、NRF-2的蛋白表達(dá)測(cè)定:以 β-actin作為內(nèi)參。提取心肌蛋白,用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度。取15μg蛋白質(zhì)樣品行SDS-PAGE電泳,電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,1%脫脂奶粉稀釋一抗 PGC-1α、NRF-1、NRF-2、β-actin分別按照1∶1000、1∶500、1∶500、1∶1000 的比例稀釋4℃孵育過夜,漂洗3次,HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG按照1∶10 000的比例稀釋,漂洗3次。使用ECL試劑盒發(fā)光顯影,放入凝膠成像系統(tǒng) Fluor Chem E中曝光顯影,使用Image J 1.44圖像分析軟件計(jì)算蛋白表達(dá)量。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組間數(shù)據(jù)符合正態(tài)、方差齊(α>0.1)時(shí)采用單因素方差分析,方差不齊時(shí)采用Dunnertt法,α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 一般狀況及游泳時(shí)間 各模型組大鼠力竭運(yùn)動(dòng)前活動(dòng)自如,皮毛光亮,一般狀況可;力竭游泳運(yùn)動(dòng)后表現(xiàn)為極度疲勞的狀態(tài):呼吸急促,運(yùn)動(dòng)遲緩,對(duì)刺激的反應(yīng)不靈敏,部分動(dòng)物甚至出現(xiàn)了結(jié)膜充血、血尿等征象。EE、LS及HS組游泳時(shí)間分別為(500.8 ± 18.0)、(580.9 ± 17.5)、(675.9 ±20.2)min,LS及HS組游泳時(shí)間較EE組明顯延長(zhǎng)(P<0.05),HS組游泳時(shí)間較LS組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。

    2.2 各組心肌蛋白表達(dá)量比較

    2.2.1 心肌PGC-1α蛋白表達(dá)量:EE、LS及HS組PGC-1α蛋白表達(dá)量均為即刻最低,6 h最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與C組比較,EE組各時(shí)相心肌PGC-1α蛋白的表達(dá)量均降低(P<0.05)。與相同時(shí)相的EE組比較,LS組即刻、6、24 h,HS組各時(shí)相心肌PGC-1α蛋白表達(dá)量均顯著增高(P<0.05)。與相同時(shí)相的LS組比較,HS組即刻、24 h PGC-1α蛋白的表達(dá)量顯著降低,6、12 h顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

    2.2.2 心肌NRF-1蛋白表達(dá)量:各組不同時(shí)相心肌NRF-1蛋白表達(dá)比較,LS組6 h表達(dá)量最高,即刻表達(dá)量最低;HS組6 h表達(dá)量最高,24 h表達(dá)量最低。與C組比較,EE組即刻、6 h、24 h心肌NRF-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與相同時(shí)相的EE 組比較,LS組6、12、24組,HS組即刻、12 h心肌NRF-1蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.05)。與相同時(shí)相的LS組比較,HS組各時(shí)相心肌NRF-1蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

    2.2.3 心肌NRF-2蛋白表達(dá)量:EE、LS及HS組NRF-2蛋白表達(dá)量均為12 h表達(dá)量最高,即刻表達(dá)量最低(P<0.05)。與C組比較,EE組即刻、6 h、24 h心肌NRF-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與相同時(shí)相的EE組比較,LS組即刻、6 h、12 h,HS組各時(shí)相心肌NRF-2蛋白表達(dá)量均顯著增高(P<0.05)。與相同時(shí)相的LS組比較,HS組6、12、24 h心肌NRF-2蛋白表達(dá)量均顯著增高(P<0.05)。見表1、圖1。

    3 討論

    在真核生物體內(nèi),細(xì)胞呼吸、能量產(chǎn)生及其他代謝過程均發(fā)生在線粒體內(nèi)。線粒體是細(xì)胞代謝活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)器,是真核生物的糖、脂肪和氨基酸進(jìn)行氧化最終釋放能量的場(chǎng)所。力竭運(yùn)動(dòng)后心肌耗氧量增加,細(xì)胞內(nèi)三磷腺苷(ATP)減少,影響細(xì)胞內(nèi)各種生化反應(yīng)的進(jìn)行,從而使心肌正常功能受到損害。PGC-1a作為線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,對(duì)維持生物活動(dòng)的能量平衡起到重要的生理意義[9]。Ventura Clapier等[10]通過對(duì)降低心肌氧化能力在心臟衰竭的發(fā)病機(jī)制中作用的研究表明,心臟及骨骼肌在壓力超負(fù)荷下由于PGC-1a及其下游的NRF-2等因子的表達(dá)下調(diào)而引起線粒體功能減弱。本研究結(jié)果顯示,所有力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠的PGC-1α、NRF-1和NRF-2的蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組,表明力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)降低心肌線粒體的功能。此外,很多研究表明在接觸外源性氧化應(yīng)激[11-13]或應(yīng)答氧化損傷[14]時(shí),線粒體生物生成會(huì)增加。本研究中各組PGC-1α和NRF-2蛋白均在力竭后即刻的表達(dá)量最低,隨時(shí)間延長(zhǎng)蛋白表達(dá)量有所升高,PGC-1α在6 h升到最高,NRF-2在12 h達(dá)高峰,無進(jìn)一步升高趨勢(shì)。表明線粒體生物發(fā)生是力竭大鼠應(yīng)對(duì)心肌缺血缺氧的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

    表1 各組大鼠心肌PGC-1α、NRF-1、NRF-2蛋白表達(dá)量比較(x±s)

    圖1 各組大鼠心肌PGC-1α、NRF-1、NRF-2蛋白表達(dá)PGC-1α.過氧化物酶增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α,NRF-1.核呼吸因子-1,NRF-2.核呼吸因子-2;C組.對(duì)照組,EE組.力竭組,LS組.低劑量紅景天苷力竭組,HS組.高劑量紅景天苷力竭組

    紅景天是多年生草本植物,多生長(zhǎng)于亞洲的高海拔地區(qū)與歐洲北極地區(qū)的干燥沙地,在惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境中表現(xiàn)出耐寒、耐干旱、耐強(qiáng)紫外線照射等特性,這表明紅景天對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力很強(qiáng),生命力非常旺盛。作為紅景天主要活性物質(zhì)SAL的臨床藥用價(jià)值很高,尤其在心血管疾病治療方面,近些年來對(duì)其研究越來越多。有研究表明,SAL對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用[15]。楊雷等[16]的研究表明,SAL能促進(jìn)心肌梗死后大鼠心肌組織血管的再生。而本研究中LS及HS組力竭游泳時(shí)間均明顯高于EE組,說明SAL能夠增強(qiáng)大鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。LS組PGC-1α、NRF-1和 NRF-2及 HS組的 PGC-1α和NRF-2蛋白表達(dá)量顯著高于EE組,說明SAL能夠上調(diào)線粒體生物發(fā)生調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子PGC-1α和NRF-2的表達(dá),低劑量SAL能夠上調(diào)NRF-1的表達(dá),從而刺激線粒體的生物發(fā)生,對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的心肌損傷起保護(hù)作用。但HS組的NRF-1蛋白表達(dá)未見上調(diào),可能是高劑量SAL通過對(duì)其他因子的調(diào)節(jié)影響了NRF-1的蛋白表達(dá),具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

    綜上所述,力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)造成心肌損傷,影響線粒體的功能,而SAL能通過刺激線粒體的生物發(fā)生形成對(duì)心肌的保護(hù)作用。SAL具有很好的開發(fā)前景,但其對(duì)心臟疾病的作用機(jī)制尚未完全清楚,仍需深入研究。

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