紅景天苷對(duì)力竭大鼠心肌線粒體呼吸功能的影響

張龍飛，崔玉娟，平 政，曹雪濱

運(yùn)動(dòng)是一種特殊的生理、病理過(guò)程，適量的運(yùn)動(dòng)有助于維持人體的健康以及提升運(yùn)動(dòng)能力，但過(guò)度的力竭運(yùn)動(dòng)則導(dǎo)致機(jī)體損傷，特別是力竭性心臟損傷［1］。力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌損傷臨床較多見(jiàn)，表現(xiàn)為各種形式，包括心臟性猝死、嚴(yán)重心律失常、心力衰竭等。線粒體是真核細(xì)胞的主要供能細(xì)胞器，是細(xì)胞發(fā)生呼吸作用的主要場(chǎng)所，通過(guò)電子傳遞呼吸鏈的氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生三磷腺苷(ATP)，供細(xì)胞利用。線粒體呼吸功能下降會(huì)導(dǎo)致能量代謝障礙，影響正常生理功能。目前的研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)及耐力訓(xùn)練與線粒體的功能之間有密切關(guān)系［2-4］?？疾炀€粒體呼吸鏈復(fù)合物的功能普遍采用將線粒體分離后測(cè)定單個(gè)線粒體復(fù)合物活性的方法，但氧化磷酸化必須在完整的線粒體中進(jìn)行，因此分離線粒體的方法不能揭示復(fù)合物如何相互作用。本課題提供一種原位分析線粒體功能的方案，可保留在細(xì)胞內(nèi)原位置和裝配條件下的線粒體功能的特征及與其他細(xì)胞器的交互作用。紅景天苷(Salidroside，SAL)是從植物紅景天中提取的一種有效成分，具有抗心肌缺血、保護(hù)缺血再灌注損傷、抗缺氧等作用，通過(guò)增加肝糖原含量，提高紅細(xì)胞和肝臟的過(guò)氧化物歧化酶活性，降低血漿、心肌、腦的過(guò)氧化脂質(zhì)含量等途徑，有效提高機(jī)體耐缺氧能力和抗疲勞能力［5-6］。本研究擬通過(guò)研究力竭運(yùn)動(dòng)及紅景天苷對(duì)大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)和線粒體呼吸功能的影響，探討紅景天苷對(duì)大鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 清潔級(jí)雄性SD大鼠［軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(京)2003-1-003］，體重(120±20)g。98%紅景天苷粉劑(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，所有用于測(cè)定線粒體呼吸功能的試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，高分辨率線粒體呼吸儀 Oxygraph-2k(奧地利Oroboros)。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥:將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照(C)組、力竭(EE)組、低劑量SAL(LS)組、高劑量SAL(HS)組，每組10只。將SAL粉劑用0.9%氯化鈉注射液分別配制成濃度為0.1 g/L及0.3 g/L的 SAL溶液，LS組與 HS組分別給予 100、300 mg/(kg·d)灌胃2周，C組與EE組給予生理鹽水10 ml/(kg·d)灌胃2周。

1.2.2 模型制備及取材:采用經(jīng)典的Thomas方法［7］制備力竭心臟損傷模型。大鼠游泳采用清潔的塑料圓桶(高55 cm，直徑50 cm)，水溫(32.0±0.5)℃，水深50 cm。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，除C組外，其他各組均參加一次力竭性訓(xùn)練。力竭標(biāo)準(zhǔn)參考Thomas力竭標(biāo)準(zhǔn)［7］:①大鼠沉入水下無(wú)法返回水面超過(guò)10 s;②大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)消失，在水中無(wú)方向性地亂竄，雖未達(dá)到10 s亦定為力竭。如果大鼠在短時(shí)間內(nèi)就達(dá)到力竭狀態(tài)，將其撈出后休息5 min，再繼續(xù)游泳運(yùn)動(dòng)，保證大鼠的游泳時(shí)間在2 h以上。在大鼠游泳過(guò)程中觀察其游泳狀態(tài)，防止因嗆水而導(dǎo)致的意外死亡。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 光鏡及電鏡觀察大鼠心室肌組織:EE、LS、HS組于力竭游泳運(yùn)動(dòng)后即刻取材，C組同時(shí)在安靜狀態(tài)下取材。取大鼠心尖部心室肌組織，用10%甲醛固定，制做5μm連續(xù)切片，HE常規(guī)染色，光鏡下觀察及照相。另取同一部位心肌組織用4%戊二醛溶液固定，磷酸緩沖液沖洗，再用1%四氧化鋨后固定，梯度丙酮脫水后用包埋劑浸透，用超薄切片機(jī)將樣品切成厚約50 nm的超薄切片，然后用醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛電子染色，最后使用投射電鏡進(jìn)行觀察及照相。

1.3.2 線粒體呼吸功能測(cè)定:①大鼠心肌的分離及透化。使用眼科剪及鑷子將心肌沿心肌纖維走行分離成束，每個(gè)束包含6～8個(gè)肌纖維(稱濕重5～7 mg)，盡量將肌纖維束相互分離。稱取5 mg Saponin加入到1 ml BIOPS分離介質(zhì)中配制成Saponin母液，然后取21μl Saponin母液加入到2 ml BIOPS分離介質(zhì)中配制成Saponin透化溶液［8］。將分離好的肌纖維放入saponin透化液中。輕微震蕩30 min使肌纖維充分透化，將透化好的肌纖維轉(zhuǎn)移到裝有MIR06呼吸介質(zhì)的試管中，輕微震蕩5 min，重復(fù)3次以洗脫透化液。②高分辨率線粒體呼吸儀測(cè)定線粒體呼吸功能［9-11］。在Oxygraph-2k高分辨率線粒體呼吸儀反應(yīng)倉(cāng)中加入呼吸介質(zhì)MIR06 2 ml，將透化好的肌纖維放入反應(yīng)倉(cāng)內(nèi)，加入蘋果酸(Malate，Mal)10 μl以及谷氨酸鈉(Glutamate，Glu)12.5 μl，待呼吸速率平穩(wěn)后再加入二磷腺苷(ADP)10μl，可得到復(fù)合物Ⅰ的態(tài)3呼吸速率。加入底物琥珀酸(Succinate，Suc)20μl激活線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ，待呼吸速率平穩(wěn)后加入復(fù)合物Ⅰ的特異抑制劑魚藤酮(Rotenone，Rot)10μl，抑制了線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的活性，得到復(fù)合物Ⅱ的呼吸速率。加入線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ的特別抑制劑抗霉素A，待呼吸速率平穩(wěn)后加入5μl TMPD和5μl抗壞血酸鹽激活線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ，得到復(fù)合物Ⅳ的呼吸速率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組符合正態(tài)、方差齊性(α＞0.1)，采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用Dunnertt法，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌顯微結(jié)構(gòu) C組:心肌結(jié)構(gòu)完整，肌纖維排列整齊，間質(zhì)無(wú)水腫，肌膜無(wú)破損，無(wú)肌纖維斷裂、變性、壞死;EE組:可見(jiàn)肌纖維斷裂、排列紊亂，間質(zhì)纖維增生、水腫，心肌細(xì)胞腫脹明顯，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);LS組、HS組:偶見(jiàn)肌纖維斷裂，間質(zhì)水腫較輕，可見(jiàn)變性病變，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，HS組大鼠心肌纖維的完整性要好于LS組，整體形態(tài)更接近C組。見(jiàn)圖1。

圖1 4組大鼠心肌顯微結(jié)構(gòu)(HE×400)A.對(duì)照組;B.力竭組;C.低劑量紅景天苷組;D.高劑量紅景天苷組

2.2 大鼠心肌超微結(jié)構(gòu) C組:可見(jiàn)完整的細(xì)胞核、線粒體，線粒體數(shù)量和形態(tài)正常，核仁明顯、肌節(jié)清晰;線粒體完整無(wú)損，無(wú)腫脹、融合、變形等。EE組:線粒體體積增大，可見(jiàn)畸形的線粒體，核端基質(zhì)內(nèi)線粒體部分嵴和少部分膜融合、模糊不清并且嵴有斷裂。LS組:線粒體周邊水腫，膜嵴融合，局部缺損。HS組:線粒體個(gè)別輕度融合，核周隙輕度擴(kuò)張，偶見(jiàn)線粒體膜破損。見(jiàn)圖2。

圖2 4組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)(×12 000)A.對(duì)照組;B.力竭組;C.低劑量紅景天苷組;D.高劑量紅景天苷組

2.3 心肌線粒體呼吸功能測(cè)定結(jié)果

2.3.1 各組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的態(tài)3呼吸速率比較:與C組相比，EE組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的態(tài)3呼吸速率明顯降低，而LS、HS組明顯高于EE組，其中HS組又明顯高于LS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.3.2 各組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ的態(tài)3呼吸速率比較:與C組相比，EE組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ的態(tài)3呼吸速率明顯降低(P＜0.05)，而 HS組明顯高于 EE組以及 LS組(P＜0.05)，LS組與 EE組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.3.3 各組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ的態(tài)3呼吸速率比較:與C組相比，EE組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ的態(tài)3呼吸速率明顯降低，HS組明顯高于LS組與EE組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而LS組與EE組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠心肌線粒體呼吸功能比較［x ± s，pmol/(s·mg)］

3 討論

3.1 紅景天苷對(duì)力竭大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)的影響有研究表明力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)對(duì)心肌的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響［12］，國(guó)內(nèi)也有研究證實(shí)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌線粒體腫脹，個(gè)別膨大成絮狀，而超大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致線粒體體積顯著增大，體表面積與體積的比值降低，嵴斷裂，基質(zhì)密度普遍降低，甚至?xí)霈F(xiàn)空泡等退行性變化［13-14］。

本研究在觀察大鼠的顯微結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，EE組大鼠心肌結(jié)構(gòu)遭到破壞，心肌細(xì)胞腫脹明顯，大量肌纖維發(fā)生斷裂、排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)纖維增生、水腫，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。其超微結(jié)構(gòu)同樣變化明顯，大鼠心肌核周基質(zhì)高度水腫，核周隙變寬，并且可以發(fā)現(xiàn)腫脹變大的線粒體，核端基質(zhì)內(nèi)線粒體部分嵴和少部分膜融合、模糊不清或缺失，少量肌纖維壞死。而SAL組大鼠心肌顯微結(jié)構(gòu)相對(duì)于EE組明顯好轉(zhuǎn)，偶見(jiàn)肌纖維斷裂，間質(zhì)水腫較輕，可見(jiàn)變性病變，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，LS組超微結(jié)構(gòu)示，線粒體周邊水腫，膜嵴融合，局部缺損。HS組超微結(jié)構(gòu)示，線粒體個(gè)別輕度融合，核周隙輕度擴(kuò)張，偶見(jiàn)線粒體膜破損。總體觀察HS組相對(duì)于LS組線粒體變異程度較輕，線粒體膜結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。

3.2 紅景天苷對(duì)力竭大鼠心肌線粒體呼吸功能的影響 人類的心臟每天要消耗大概30 kg ATP以支持收縮活動(dòng)［15］，其中 90% 來(lái)源于線粒體［16］。線粒體是真核細(xì)胞的主要供能細(xì)胞器，是細(xì)胞發(fā)生呼吸和氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的主要場(chǎng)所。線粒體的基本功能就是轉(zhuǎn)換底物的氧化還原勢(shì)能為質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)能，質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)能再轉(zhuǎn)化為ATP的高能磷酸鍵［17］。線粒體中物質(zhì)脫下的氫，經(jīng)一系列酶及其輔酶輔基連續(xù)的傳遞作用，最后與激活的氧化合成水并釋放能量的過(guò)程與細(xì)胞攝取氧的呼吸過(guò)程有關(guān)，故稱電子傳遞呼吸鏈。電子傳遞鏈參與將食物轉(zhuǎn)化成化學(xué)能的過(guò)程，將能量以ATP的形式儲(chǔ)存供細(xì)胞利用。線粒體呼吸鏈的電子傳遞是由5個(gè)酶呼吸鏈復(fù)合物(呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ)構(gòu)成，其中呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ(NADH-CoQ還原酶)、呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ(琥珀酸-CoQ還原酶)、呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ(CoQ-細(xì)胞色素C還原酶)及呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ(細(xì)胞色素氧化酶)是構(gòu)成酶呼吸鏈復(fù)合物的重要組成部分，其活性變化能直接或間接地反映線粒體的功能變化，線粒體不能充足地供應(yīng)ATP就會(huì)導(dǎo)致能量衰竭［18］。

既往對(duì)線粒體功能的分析多采用體外分離法［19-20］，即通過(guò)離心的方法將線粒體從組織中提取出來(lái)，然后通過(guò)Clark氧極法［21］來(lái)測(cè)定線粒體的呼吸功能。雖然該方法也能夠通過(guò)測(cè)定線粒體不同呼吸狀態(tài)時(shí)的耗氧量反映其氧化磷酸化能力，但是體外提取法有如下弊端:①線粒體性質(zhì)容易受到分離步驟的影響，尤其是從病理?yè)p傷組織中提取的線粒體，這種影響體現(xiàn)得更加顯著［22］。②需要大量的細(xì)胞(200×106)或組織(濕重500 mg以上)，以分離出高質(zhì)量的線粒體。③一些提取方法可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)某一種線粒體族群的特別選擇。腫脹的線粒體密度會(huì)降低，因此離心提取線粒體時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)完整細(xì)胞器的優(yōu)先選擇，從而使得病理的細(xì)胞器所占比例下降。④分離提取線粒體會(huì)破壞正常的線粒體間的相互作用。大量的研究證明，正常線粒體間的相互作用對(duì)于代謝通道、內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換等至關(guān)重要［23］。本實(shí)驗(yàn)采用原位法測(cè)定線粒體的功能，即通過(guò)透化細(xì)胞膜而不破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，使得各種底物可以直接參與線粒體的呼吸過(guò)程。應(yīng)用原位法不僅可以避免體外分離法的弊端，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)在完整細(xì)胞系統(tǒng)中、正常的細(xì)胞器位置和裝配下，保留與細(xì)胞骨架、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用，完成對(duì)線粒體的分析。因此，原位分析法比體外分離法更能接近正常細(xì)胞的生理狀態(tài)。

既往有研究指出，在動(dòng)物心臟中，線粒體的缺陷將導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ以及ATP合成酶活性的降低［24-26］。本研究發(fā)現(xiàn)EE組大鼠線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的態(tài)3呼吸速率明顯低于C組，說(shuō)明力竭大鼠的線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性降低，線粒體的呼吸功能下降。其可能的機(jī)制有氧化應(yīng)激［27-28］、鈣超載［29］、電子漏引起質(zhì)子漏等假說(shuō)［30-31］。應(yīng)用SAL后，大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的態(tài)3呼吸速率明顯升高，說(shuō)明此時(shí)線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性增加。在ADP充足的態(tài)3呼吸時(shí)，通過(guò)線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化反應(yīng)，ATP大量生成以供細(xì)胞利用，并維持細(xì)胞的正常生理功能，從而實(shí)現(xiàn)了SAL對(duì)大鼠心肌的保護(hù)作用。其中，HS組線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的態(tài)3呼吸速率均明顯高于LS組，則說(shuō)明SAL對(duì)大鼠心肌的保護(hù)作用呈劑量依賴性。

綜上所述，SAL能夠預(yù)防力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的損傷，提高心肌線粒體的呼吸功能，從而發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)作用，并且高劑量SAL的效果要優(yōu)于低劑量，但SAL更深層次的心肌保護(hù)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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