基于中西醫(yī)結(jié)合方法的大鼠過敏性紫癜模型的建立*

張曉強 王 娟 劉品莉 程玉釧

周曉莉 趙劍鋒 趙惠萍 張劍 陳 鑫山西省中醫(yī)醫(yī)院風濕免疫科(太原030012)

目前鮮有關(guān)于過敏性紫癜(AP或HSP)動物模型的文獻報道，有關(guān)本病病因、病機的探索、治療方法的評價和新藥的研發(fā)在很大程度上受到限制。本實驗創(chuàng)造性地采用中西醫(yī)結(jié)合思路造模。制作出較為相似、可靠的HSP大鼠模型，且其臨床指標、病理改變均接近人類HSP?，F(xiàn)報道如下。

1 實驗方法 1．1 材料與方法 1．1．1動物與分組:健康純種SD大鼠40只，清潔級，體重(180±20g)，6周齡，♀♂各半，由山西省中醫(yī)藥研究院動物室供應(使用許可證:SYXK(晉)2010-0002，質(zhì)量合格證:0000036)，實驗期間大鼠飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥研究院中心實驗室動物房。適應喂養(yǎng)1周后對40只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組和對照組(各20只)，依據(jù)分組不同分籠飼養(yǎng)于代謝籠中，自由攝取標準飼料及水。之后對模型組大鼠進行造模。期間對照組采用等量生理鹽水灌胃及注射。

1．1．2 主要試劑和儀器:主要試劑和藥物:胡椒、干姜、蓽茇中藥配方顆粒劑(批號分別為:1008098，1011058，1007020，江陰天江藥業(yè)有限公司);脂多糖(LPS)10mg裝(批號326A055，Sigma L2880，北京索萊寶科技有限公司);雞卵蛋白(OVA)普通級，10g裝(批號 20110112，Sigma A5253，北京索萊寶科技有限公司分裝);氫氧化鋁凝膠4%g/mL，100mL裝(批號201102103，天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司);伊文思藍(批號7116588，國藥集團化學試劑有限公司);0．9%氯化鈉注射液2．25g，250mL(批號 N12040304-1，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)。

1．1．3 方法:1．1．3．1血熱證動物模型的建立:干姜、蓽茇、胡椒以1:1:1比例在60℃恒溫水浴鍋上濃縮成12．5g%mL水溶液，置4℃冰箱儲存?zhèn)溆?。將動物適應實驗環(huán)境1周后予模型組大鼠灌胃，0．14 g/只，均2次/d，對照組給予等量生理鹽水灌胃，自由飲食。用藥3周。

1．1．3 ．2 過敏反應試驗:之后將模型組大鼠給予腹腔注射含OVA1mg+氫氧化鋁凝膠0．5mL+800ng LPS+1%伊文思藍的生理鹽水1mL/只，1次/7d，共2次。第二次注射后10min內(nèi)皮膚外涂含OVA1mg+氫氧化鋁凝膠0．5mL+800ng LPS的生理鹽水1mL/只進行激發(fā)過敏反應。對照組用等量生理鹽水操作。激發(fā)過敏30min后處死動物，剪取背部皮膚，觀察皮內(nèi)層的出血點。

1．2．2 模型觀察與指標檢測:1．2．2．1 一般狀況觀察:包括不同組別、不同時段鼠體溫、精神狀況、進食進水量、毛被、活動量、舌苔、口唇、結(jié)膜、耳廓、糞便顏色和硬軟度、尿液量、顏色、氣味等。

1．2．2 ．2 實驗室指標測定:在實驗前、實驗結(jié)束時，兩組大鼠隨機處死10只。處死大鼠前24h留取尿液，用全自動尿液分析儀測定尿常規(guī)和尿沉渣定量。之后對上述大鼠取血約10mL，1h內(nèi)用全自動血流變分析儀觀測血液流變性(包括全血粘度、血沉等);用全自動血細胞分析儀觀測血常規(guī)(血小板計數(shù)、白細胞計數(shù)等)。

1．2．2 ．3 皮膚和腎臟一般觀察及病理檢查:觀察兩組不同時段實驗大鼠皮內(nèi)層有無瘀點、瘀斑出現(xiàn)。在實驗前、實驗結(jié)束時，兩組大鼠各取4只，觀察腎臟外形，并切取部分腎組織置于40g/L中性甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，分別行HE染色，在光鏡下觀察腎組織病理改變。

1．2．3 統(tǒng)計學處理:資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差示，由SPSS 16．0軟件統(tǒng)計處理，采用One-Way ANOVA單因素方差分析，LSD和S-N-K法作組間比較。

2 結(jié)果與分析 2．1 一般情況 對照組大鼠精神、攝食均較正常;模型組大鼠在進行了3周中藥灌胃后出現(xiàn)不同程度的口渴喜飲、進食量稍大、精神萎靡不振或煩躁、呼吸頻率增高、口唇發(fā)干、耳廓赤紅、眼結(jié)膜充血、糞便干燥、小便發(fā)黃、偶見鼻衄。在第1次腹腔注射含OVA1mg+氫氧化鋁凝膠0．5mL+800ng LPS+1%伊文思藍的生理鹽水后出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、鼠毛蓬亂，在第2次注射后情況加重，并有2例大鼠死亡(死因可能系超敏反應)，之后各組大鼠均未出現(xiàn)死亡。在進行皮毛外涂擦上述藥物后，有部分皮膚紫癜出現(xiàn)(見圖1-1，1-2)，此情況約1周可自行緩解。

2．2 尿液檢查 2．2．1血尿:對照組大鼠在實驗過程均未出現(xiàn)肉眼血尿和鏡下血尿。造模前模型組大鼠尿紅細胞計數(shù)陰性，在造模后大鼠均出現(xiàn)紅細胞超量。試驗后模型組大鼠尿紅細胞計數(shù)較實驗前及對照組試驗后顯著增多 (均P＜0．01)。見表1。

表1 對照組與模型組尿紅細胞計數(shù)比較(個/μl)( ±s)

表1 對照組與模型組尿紅細胞計數(shù)比較(個/μl)( ±s)

注:與對照組相比△P＜0．05▲P＜0．01;與實驗前相比◇P ＜0．05 ◆P ＜0．01。下同。

組別 動物數(shù) 實驗前 試驗后對照組10 5．00 ±1．31 4．88 ±1．36模型組 10 5．27 ±0．41 18．52 ±1．28▲◆

2．2．2 尿蛋白:造模前模型組大鼠尿蛋白定性陰性，在造模后模型組出現(xiàn)尿蛋白。試驗后模型組大鼠尿蛋白定量較實驗前及對照組試驗后顯著增多(均P＜0．01)。見表2。

2．3 血液檢查 2．3．1血液流變性:造模后動物的全血粘度較造模前及對照組試驗后在低切、中切、高切下明顯增高(P＜0．01或P＜0．05);造模后動物的血沉較造模前及對照組試驗后明顯增高(均P＜0．01)。表明血液粘度增高，流動性變差;紅細胞聚集性增加。見表3及表4。

2．3．2 血常規(guī):造模后動物的PLT、WBC值較造模前及對照組試驗后明顯增高(P＜0．01)，表明免疫炎癥狀態(tài)較重。見表5。

表2 對照組與模型組尿蛋白定量變化(mg/24h)( ± s)

表2 對照組與模型組尿蛋白定量變化(mg/24h)( ± s)

組別 n 實驗前 試驗后對照組10 49．72 ±3．57 51．11 ±4．33模型組 10 47．48 ±3．42 152．52 ±21．39▲◆

表3 模型組與對照組大鼠全血粘度(mPa/s)比較±s

表3 模型組與對照組大鼠全血粘度(mPa/s)比較±s

組 別 n 低切實驗前 試驗后中切實驗前 試驗后高切實驗前 試驗后對照組 10 13．30 ±2．88 13．17 ±3．40 5．16 ±0．81 4．97 ±0．92 4．42 ±1．03 4．73 ±1．09模型組 10 12．97 ±2．48 14．26 ±4．10▲◆ 5．47 ±0．73 7．29 ±0．56▲◆ 4．52 ±0．94 6．15 ±0．90▲◆

表4 模型組與對照組大鼠血沉比較±s(mm/h)

表4 模型組與對照組大鼠血沉比較±s(mm/h)

組別 n 實驗前 試驗后對照組10 8．78 ±3．37 9．06 ±5．09模型組 10 9．12 ±3．56 79．72 ±13．57▲◆

2．4 腎組織病理學改變 對照組大鼠實驗前后腎表面光滑，顏色淺褐，皮、髓質(zhì)分界清晰。模型組部分大鼠腎腫大，顏色暗紅，個別表面可發(fā)現(xiàn)皺起，皮、髓分界可見模糊。光鏡觀察顯示模型組大鼠腎臟表現(xiàn)出部分腎小球分葉不明顯，系膜區(qū)略增寬，輕中度的系膜細胞和基質(zhì)增生，基底膜增厚，膠原纖維沉積增多(黑褐色)，提示HSP模型亦有同人類患者相似的腎臟受損(見圖 1、圖2、圖3、圖4)。

表5 模型組與對照組大鼠血常規(guī)指標比較(×109)(±s)

表5 模型組與對照組大鼠血常規(guī)指標比較(×109)(±s)

組 別 nPLT實驗前 試驗后WBC實驗前 試驗后對照組 10 735．96 ±127．55 729．15 ±127．13 8．49 ±2．56 8．70 ±2．83模型組 10 689．34 ±135．27 1116．79 ±224．89▲◆ 8．66 ±1．91 14．91 ±3．77▲◆

3 討 論 過敏性紫癜(Ailegric Puprura，AP)，又稱亨諾-許蘭紫癜(Henoch-schonlein purpura，HSP)，是一種常見的血管變態(tài)反應性出血性疾病［1］。本病并發(fā)癥多，復發(fā)率高，病程遷延，患病率逐年升高［2-3］。有關(guān)HSP的研究已成為近年來過敏性疾病研究的熱點之一。目前本病病因尚不完全明了，一般認為與過敏有關(guān)，但在臨床上致敏原常不易確定。眾多研究發(fā)現(xiàn)該病病理主要是免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，IgA)介導的變態(tài)反應性疾?。?］，多克隆B淋巴細胞(B Lymphocyte，BC)活化及 Ig的分泌增加［5］。血管壁免疫復合物(Immunocomplex，IC)沉著，通透性增高，血液及淋巴液滲到組織間隙，引起皮膚黏膜、內(nèi)臟器官滲出性出血和水腫。本病發(fā)病同時有細胞因子和炎癥介質(zhì)的參與，凝血機制也參與發(fā)病，遺傳免疫因素的作用不可忽視。Moja等［6］在檢測HSP患者血清后認定IgAI、分泌型IgA及抗麥膠蛋白IgA是HSP致病的重要抗體。另有多篇報道認為HSPN和IgA腎病(IgAnephropathy，IgAN)在腎臟病理改變上極為相似，難以區(qū)分，都是由IgA免疫異常所致。另有國內(nèi)學者對HSP患兒進行血液流變學研究發(fā)現(xiàn)，無論是全血表觀黏度、血液黏度、還是血漿黏度均增高，并有血沉增高，紅細胞壓積增大，提示存在高粘滯血癥［7］，可加重免疫介導炎癥反應。

上述研究成果與中醫(yī)學對HSP病因病機的理解不謀而合，中醫(yī)認為HSP患者多為先天稟賦偏頗，復感外邪而發(fā)病:患者先天陰虛質(zhì)燥，營血之中已有伏火，復受風熱、溫熱或藥毒之邪，從而兩熱相搏，深入血分釀成本病。張蕊鸝［8］在碩士論文中通過對普通兒童和HSP兒童體質(zhì)分布的研究，結(jié)果顯示小兒的體質(zhì)特點是決定HSP發(fā)生的內(nèi)因。HSP兒童中醫(yī)體質(zhì)不均衡質(zhì)構(gòu)成比以偏陰虛質(zhì)(64．38%)最多，偏陰虛質(zhì)與HSP的發(fā)病有緊密聯(lián)系。而中醫(yī)血熱證動物模型具有較強的高粘滯血癥、免疫活化及一般表現(xiàn)如皮膚紫斑、發(fā)熱、煩躁、耳紅、眼赤、溲赤、便干等［9-11］。

本實驗創(chuàng)造性地模擬HSP的病因病機進行其模型的制備，即根據(jù)HSP的公認的現(xiàn)代醫(yī)學研究成果，從病因、病理等諸方面和中醫(yī)學HSP病人體質(zhì)特點，采用中西醫(yī)結(jié)合思路造模(即使實驗動物達到“病證結(jié)合，病癥統(tǒng)一”的目的)。首先參照文獻建立血熱證動物模型造就實驗動物陰虛火旺的偏頗體質(zhì)，后應用麥膠蛋白作為飲食抗原，持續(xù)性抗原刺激粘膜免疫系統(tǒng)，致BC多克隆活化，并應用經(jīng)典的皮膚過敏手段建立HSP大鼠動物模型。本大鼠模型與對照組大鼠各組指標差異均具有統(tǒng)計學意義。造模組的全血粘稠度、白細胞、血小板、尿液分析及沉渣定量等指標與對照組相比有明顯差異(P＜0．01或P＜0．05)。本實驗所建立的HSP大鼠動物模型接近于HSP現(xiàn)代醫(yī)學研究成果，并與中西醫(yī)學認識的HSP患者體質(zhì)特點合拍，基本達到“病證結(jié)合，病癥統(tǒng)一”。

2011年筆者發(fā)表《過敏性紫癜動物模型的研制思路》后，國內(nèi)數(shù)家研究單位及學者通過筆者的實驗思路［12］與本實驗基本同步進行了研究。如張奕星［13］等，綜合模擬瘀熱證與IgA腎病實驗動物模型，復合建造HSPN模型，模型組大鼠雖然未出現(xiàn)明顯皮下紫癜，但存在血尿及蛋白尿，腎臟病理及免疫組化結(jié)果支持造模成功;李彥紅［14］等通過對日本大耳白兔熱性藥物的喂飲、腹腔注射卵白蛋白和弗氏完全佐劑生理鹽水的混合液，耳緣靜脈和背部皮內(nèi)注射卵白蛋白生理鹽水，激發(fā)過敏反應來構(gòu)建HSP模型，結(jié)果顯示大耳白兔癥狀、病理改變和實驗室檢查結(jié)果與人類HSP病變基本相似，有望構(gòu)建良好的(HSP)兔模型。

另外韓冰虹［15］在2004年度黑龍江中醫(yī)藥大學博士學位論文的實驗里采用口服麥膠蛋白的飲食抗原法建立的HSP動物模型，選用20只昆明種雌性小鼠模型實驗，僅有3例小鼠出現(xiàn)了皮下紫癜表現(xiàn)，其皮膚和腎臟組織形態(tài)學變化，與患者皮膚、腎臟病理改變基本一致。張雅絢［16］在2010年度遼寧中醫(yī)藥大學碩士學位論文的實驗里采用卵白蛋白為抗原免疫家兔，之后在家兔背部皮內(nèi)注射卵白蛋白局部激發(fā)arthus反應(局限性免疫復合物沉積引起的變態(tài)反應)，只是在針刺部位出現(xiàn)皮膚紅、腫、熱之表現(xiàn)。上述模型的制作為高相似度HSP動物模型建立打下了一定的基礎(chǔ)，其功勞值得肯定。

3 展望及不足 本課題所設計的動物模型思路也將廣泛應用于其它HSP研究。從而使中西醫(yī)學對HSP以及其他類似疾病的科研及診治跨上一個新臺階。

由于實驗條件的限制、時間緊張及筆者的能力所限，本實驗尚有指標檢測方面的遺憾，如本實驗未能測定大鼠血清白蛋白、球蛋白、補體等免疫指標;本實驗并沒有使大多數(shù)模型大鼠出現(xiàn)皮膚紫癜表現(xiàn)。期待在以后的實驗中可以得到完善和改進。

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