諾麗莖段的離體再生1)

潘曉晴 吳 田 藍(lán)增全 吳騰超 陶燕藍(lán)

(西南林業(yè)大學(xué)，昆明，650224)

諾麗(Morinda citrifolia Linn.)屬巴戟天屬茜草科，灌木至小喬木［1］，生長于溫暖潮濕的熱帶、亞熱帶地區(qū)，在國外主要分布于美國夏威夷、澳大利亞、印度、印度尼西亞等國，在我國主要生長于云南省西雙版納、海南及臺(tái)灣南部地區(qū)［2－4］。諾麗含有多種必需氨基酸、維生素、微量元素及其他多種生物堿、多醣體、多種酵素等極具醫(yī)學(xué)價(jià)值的成分［5－6］。據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，諾麗果汁對(duì)于小鼠的血壓、血脂的下降具有顯著效果。近年來還發(fā)現(xiàn)，諾麗果汁對(duì)不同原因的肝損傷有肝保護(hù)作用［7－8］。

賀紅等［9］對(duì)同屬巴戟天屬的藥用植物巴戟天做了帶腋芽的莖節(jié)的離體培養(yǎng)，吳田［10］對(duì)諾麗進(jìn)行過帶腋芽的莖段的離體培養(yǎng)，均建立了高效的離體快速繁殖體系。此外，謝江［4］以諾麗的根作為外植體，進(jìn)行了諾麗的離體再生培養(yǎng)的研究。本研究擬以諾麗不帶腋芽的莖段為外植體，進(jìn)行離體再生研究，為建立諾麗的高效轉(zhuǎn)基因體系與進(jìn)行基因改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

所用材料為西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院組培室的諾麗無菌試管苗。試管苗每80 d 左右繼代一次，所用培養(yǎng)基為3% MS+0.2 mg/L NAA。

1.1 培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為3% MS;愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度的6－BA 及NAA，并設(shè)置質(zhì)量濃度梯度，為表1中1 ～12 號(hào)培養(yǎng)基;分化培養(yǎng)基有2 種，一種為芽分化培養(yǎng)基，分別添加2.0、3.0、4.0 mg/L 6－BA 的3% MS 培養(yǎng)基，另一種為根分化培養(yǎng)基，分別添加0.02、0.05、0.1 mg/L NAA 的3% MS 培養(yǎng)基。所用培養(yǎng)基的pH 值均為5.8，瓊脂0.6%，蔗糖3%，121 ℃滅菌20 min。培養(yǎng)條件均為光照1 500 lx、12 h/d、(28 ±2)℃。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.2 莖薄片愈傷組織誘導(dǎo)

將諾麗的無菌苗取出，剪去葉片，留下莖尖以下兩節(jié)帶芽莖段。去除莖段兩端腋芽，取莖段中間部分切成1 ～2 mm 的薄片，平放于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(圖1)，每天觀察，做形態(tài)及顏色記錄。

圖1 諾麗莖薄片的切取與擺放

1.3 離體再生

1.3.1 模式Ⅰ:先誘導(dǎo)分化不定芽后誘導(dǎo)分化不定根分別將培養(yǎng)于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基12、18、24 d的莖薄片轉(zhuǎn)移到芽分化培養(yǎng)基中，45 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率((出芽的愈傷數(shù)/總愈傷數(shù))×100%)。待不定芽生長至1 cm 左右時(shí)，從基部切下，置于生根培養(yǎng)基(分別添加0.05、0.1、0.2、0.3 mg/L NAA 的3% MS培養(yǎng)基)中，觀察開始生根的時(shí)間，并統(tǒng)計(jì)30 d 時(shí)的生根率((生根的不定芽數(shù)/總不定芽數(shù))×100%)。

1.3.2 模式Ⅱ:先誘導(dǎo)分化不定根后誘導(dǎo)分化不定芽分別將培養(yǎng)于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基12、24、36 d 的莖薄片轉(zhuǎn)移到根分化培養(yǎng)基中，60 d 后統(tǒng)計(jì)分化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對(duì)莖薄片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

莖薄片在不同的愈傷組織培養(yǎng)基中均可以在10 d 左右開始膨大，并陸續(xù)出現(xiàn)愈傷組織。當(dāng)6－BA 的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，NAA 的質(zhì)量濃度為0.05 和0.10 mg/L 時(shí)(表2)，莖薄片能夠生出嫩綠色的愈傷組織(圖2a)，狀態(tài)較好，而NAA 的質(zhì)量濃度為0.02 和0.15 mg/L 時(shí)，愈傷組織的顏色為黃褐色(圖2b)，且狀態(tài)較差;當(dāng)6－BA 的質(zhì)量濃度為2.0和3.0 mg/L，NAA 在實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的4 個(gè)質(zhì)量濃度梯度下，莖薄片均生出黃褐色且狀態(tài)較差的愈傷組織。因此，誘導(dǎo)諾麗莖薄片產(chǎn)生愈傷組織的最優(yōu)培養(yǎng)基為3% MS+1.0 mg/L 6－BA+0.05 mg/L NAA。

2.2 芽分化培養(yǎng)基中不同質(zhì)量濃度的6－BA 及愈傷組織幼嫩程度對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響

將培養(yǎng)于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同時(shí)間(12、18、24 d)的莖薄片轉(zhuǎn)移到芽分化培養(yǎng)基中，當(dāng)6－BA 的質(zhì)量濃度為2.0 mg/L 時(shí)，第12 天的愈傷組織的不定芽的分化率最低，為33.3%，第24 天的愈傷組織的不定芽的分化率最高，為50%;當(dāng)6－BA 的質(zhì)量濃度為3.0 mg/L 時(shí)，3 種培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織的不定芽的分化率均能達(dá)到50%以上，其中，第18天的愈傷組織的不定芽的分化率最高，為55.6%;當(dāng)6－BA 的質(zhì)量濃度為4.0 mg/L 時(shí)，3 種培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織的不定芽的分化率均在50%以下(表3)。能夠分化出不定芽的愈傷組織，均能生出1 ～4棵不定芽(圖3)。因此，誘導(dǎo)諾麗莖薄片愈傷組織分化不定芽的最適材料為培養(yǎng)18 d 的愈傷組織，最優(yōu)培養(yǎng)基為3% MS+3.0 mg/L 6－BA。

表2 不同激素種類及質(zhì)量濃度對(duì)莖薄片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表3 6－BA 與愈傷組織的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織分化出不定芽的影響

2.3 NAA 質(zhì)量濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)生根的影響

當(dāng)不定芽生長至1 cm 以上時(shí)，由基部將其剪下，轉(zhuǎn)移至含有的NAA 的生根培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度為0.2 mg/L 時(shí)，最早生根，為轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中的第17 天，當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度為0.05和0.3 mg/L 時(shí)，生根均較晚;當(dāng)不定芽轉(zhuǎn)移至NAA質(zhì)量濃度為0.1 和0.2 mg/L 的生根培養(yǎng)基，第30天時(shí)的生根率均為100%(表4)。因此，誘導(dǎo)不定芽生根的最優(yōu)培養(yǎng)基為3% MS+0.2 mg/L NAA(圖4)。

表4 NAA 質(zhì)量濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)生根的影響

圖2 諾麗莖薄片誘導(dǎo)出的愈傷組織

圖3 愈傷組織誘導(dǎo)分化出的不定芽

圖4 不定芽誘導(dǎo)分化出不定根

2.4 根分化培養(yǎng)基中不同質(zhì)量濃度的NAA 及愈傷組織幼嫩程度對(duì)誘導(dǎo)不定根、叢生芽的影響

將培養(yǎng)于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同時(shí)間(12、24、36 d)的莖薄片轉(zhuǎn)移到芽分化培養(yǎng)基中，當(dāng)NAA的質(zhì)量濃度為0.02 mg/L 時(shí)，3 種培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織的不定根的分化率均在80.6%以下;當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.05 和0.1 mg/L 時(shí)，3 種培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織的不定根分化率均能達(dá)到80%以上，其中，NAA 質(zhì)量濃度為0.05 mg/L、第36 天的愈傷組織的不定根分化率最高，為93.8%(表5)。不定根誘導(dǎo)后無須經(jīng)過更換培養(yǎng)基，一周內(nèi)均可以出現(xiàn)叢生芽(圖5)。因此，誘導(dǎo)諾麗莖薄片的愈傷組織先分化不定根再分化出不定芽途徑的最適材料為培養(yǎng)36 d的愈傷組織，最優(yōu)培養(yǎng)基為3% MS+0.05 mg/L NAA。

表5 NAA 的質(zhì)量濃度與愈傷組織的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)不定根與產(chǎn)生叢生芽的影響

圖5 愈傷組織在根分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出根與叢生芽

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以諾麗不含腋芽的莖段薄片為外植體，建立了兩種離體再生模式(模式Ⅰ為先誘導(dǎo)不定芽后誘導(dǎo)不定根;模式Ⅱ?yàn)橄日T導(dǎo)不定根后誘導(dǎo)不定芽)。用于模式Ⅰ和模式Ⅱ的愈傷組織的誘導(dǎo)時(shí)間分別為12、18、24 d 和12、24、36 d，兩種模式使用的誘導(dǎo)時(shí)間差異較大主要是因?yàn)樵谡T導(dǎo)后續(xù)分化時(shí)，莖的誘導(dǎo)時(shí)間為36 d 時(shí)，不定芽的出芽率極低，并且莖的誘導(dǎo)愈傷時(shí)間越短，出芽時(shí)間越早。在模式Ⅱ中，隨著莖的誘導(dǎo)愈傷的時(shí)間的增加，根的分化率也相應(yīng)升高，但是當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間過長時(shí)，愈傷組織逐漸變黑死亡。

在模式Ⅱ的再分化模式中，不同的NAA 質(zhì)量濃度下，愈傷組織的生根能力都比較強(qiáng)，且培養(yǎng)時(shí)間越長的愈傷組織的生根率越高，表明在諾麗莖段脫分化的過程中伴隨了促進(jìn)生根的物質(zhì)產(chǎn)生，配合外源添加的NAA 達(dá)到了較好的生根效果。在原培養(yǎng)基中，已經(jīng)生根的愈傷組織能夠繼續(xù)分化出不定芽，說明根的生出能夠促進(jìn)愈傷組織的再分化能力，可能原因?yàn)楦軌驈呐囵B(yǎng)基中吸取營養(yǎng)物質(zhì)，或者是根本身能夠產(chǎn)生促進(jìn)分化的化學(xué)物質(zhì)。

在誘導(dǎo)不定芽生根的試驗(yàn)中，當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度為0.1 和0.2 mg/L 時(shí)，能夠顯著縮短生根時(shí)間且能提高生根率，當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度為0.05 和0.3 mg/L時(shí)，開始生根的時(shí)間分別為第50 天和第60 天，說明適量質(zhì)量濃度的NAA 使不定芽的切口處形成微量的愈傷組織保持疏松狀態(tài)，有利于水分、養(yǎng)分的吸收［11］，且有較好的促進(jìn)生根的作用。

選取諾麗的莖的薄切片為外植體，一節(jié)不帶腋芽的莖段就能夠提供若干份培養(yǎng)材料，這在實(shí)際生產(chǎn)中能夠大量的節(jié)約生產(chǎn)材料。在取外植體時(shí)，一般僅剪取諾麗植株枝條的前兩節(jié)幼嫩莖段，對(duì)植株的生長無迫害作用，反而能夠促使母株抽出更多的枝條。

組織培養(yǎng)褐變是酚類物質(zhì)被氧化產(chǎn)生深色物質(zhì)的結(jié)果［12］，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)外植體材料產(chǎn)生毒害作用，使之死亡［13］。植物組培試驗(yàn)中，不同激素的共同作用，會(huì)對(duì)外植體的生長、分化產(chǎn)生顯著的調(diào)節(jié)作用，使用了合適的激素組合時(shí)，能夠抑制外植體的褐化，并且能夠促使外植體進(jìn)一步的生長、分化。在培養(yǎng)基中加入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可以改變和影響外植體的內(nèi)源激素水平，從而導(dǎo)致外植體在附加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)頻率差異很大［14］。適當(dāng)添加外源激素可以提高諾麗離體再生的頻率進(jìn)而節(jié)省培養(yǎng)時(shí)間［10］。本試驗(yàn)中，使用了相對(duì)廉價(jià)的6－BA 和NAA，這在實(shí)際大規(guī)模生產(chǎn)中能夠大量節(jié)省生產(chǎn)成本。

在模式Ⅰ里，愈傷組織的質(zhì)地較緊實(shí)，顏色為嫩綠色，很多研究表明，結(jié)構(gòu)致密的綠色或淺綠色愈傷組織的分化潛力大［15－17］，不定芽從莖薄片愈傷的邊緣和中間位置均有生出。在模式Ⅱ里，誘導(dǎo)不同時(shí)間的愈傷組織接入誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基中后，能夠迅速的分化出新的黃色的愈傷組織，進(jìn)而分化出不定根和叢生芽。使用這兩種模式產(chǎn)生離體再生植株各有特點(diǎn)，模式Ⅰ產(chǎn)生單株再生苗的速度要快于模式Ⅱ，而模式Ⅱ由于能夠產(chǎn)生叢生芽，因此能夠一次收獲若干株再生苗。在實(shí)際生產(chǎn)生活中可以根據(jù)需要選擇相應(yīng)的再生模式。

［1］ 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志:71 卷［M］.北京:科學(xué)出版社，1999.

［2］ 黃騏，何文錦，葉冰瑩，等.諾麗(Morinda citrifolia L.)離體快速繁殖研究［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，23(1):87－90.

［3］ 中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒:第4 冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，1975.

［4］ 謝江，吳田，張婷婷，等.海濱木巴戟愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(6):47－48，130.

［5］ 許國平，張春妮.諾麗作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2007，20(9):974－977.

［6］ 李法營，藍(lán)增全，劉昌芬，等.諾麗研究進(jìn)展(一):國內(nèi)外研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(32):15819－15821.

［7］ 謝文利，朱江，晉玉章.諾麗果汁對(duì)D－半乳糖胺致肝損傷的保護(hù)作用［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(9):17－19.

［8］ 劉印忠，馬德祿，高建華，等.諾麗果汁對(duì)四氯化碳引起肝損傷小鼠的肝保護(hù)作用［J］.天津藥學(xué)，2008，20(2):6－8.

［9］ 賀紅，肖省娥，冼建春，等.巴戟天離體培養(yǎng)及植株再生的研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17(4):353－354.

［10］ 吳田，藍(lán)增全.諾麗離體培養(yǎng)研究［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42(2):179－182.

［11］ 朱麗華，吳小芹，戴培培，等.赤松離體培養(yǎng)植株再生體系的建立［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，34(2):11－14.

［12］ 姚洪軍，羅曉芳，田硯亭.植物組織培養(yǎng)外植體褐變的研究進(jìn)展［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21(3):78－84.

［13］ 董建華.幾種熱帶水果的褐變與PPO［J］.熱帶作物研究，1990(2):92－99.

［14］ 蔣剛強(qiáng)，曾幼玲，張富春.灰綠藜幼嫩花序的組織培養(yǎng)及植株再生［J］.武漢植物學(xué)研究，2007，25(4):413－416.

［15］ 尚旭嵐，徐錫增，方升佐.青錢柳離體胚的培養(yǎng)及快速繁殖［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，31(1):101－105.

［16］ 康冰，王關(guān)平，張小紅，等.歐美黑楊離體再生途徑及影響因子的研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2004，24(12):2355－2358.

［17］ 田敏，韓凝，邊紅武，等.草莓愈傷組織再生能力與活性氧代謝水平相關(guān)性研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，2004，31(3):372－374.