微生物多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用及其機(jī)制＊

李 晶 錢 文 陳靠山，2 王國棟

1 皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖 241002； 2 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家糖工程技術(shù)研究中心

巨噬細(xì)胞起源于血單核細(xì)胞，是一類古老而又系統(tǒng)發(fā)育保守的免疫細(xì)胞，它和中性粒細(xì)胞一起組成了上皮屏障后宿主防御的第一道防線，在非特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，此外巨噬細(xì)胞還可以作為抗原遞呈細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞相互作用來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答［1］。許多生物活性物質(zhì)都可以激活處于靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，被激活的巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生和分泌多種細(xì)胞信號(hào)分子和細(xì)胞因子，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、促炎或抗炎、趨化等作用［2］。此外，巨噬細(xì)胞還在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、清除凋亡細(xì)胞和造血的組織重構(gòu)過程中扮演了重要的角色［3，4］。

糖類是構(gòu)成生命的三大基本物質(zhì)之一，而多糖是一類由10個(gè)以上單糖通過糖苷鍵鏈接而成的大分子物質(zhì)，除了具有重要的生理意義外，部分多糖還具有良好的藥理學(xué)活性，例如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎癥、抗病毒及抗氧化等功能［2］。其中免疫調(diào)節(jié)是多糖最重要的藥理學(xué)活性之一，由于巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，并且在一定程度上能夠影響機(jī)體的適應(yīng)性免疫，因此能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能就可以理解為能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力［1］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，許多從植物、動(dòng)物、微生物中得到的多糖都能激活巨噬細(xì)胞，繼而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能［5］。在這些不同來源的生物活性多糖中，微生物多糖由于其生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、氣溫等條件限制，且產(chǎn)量高、純化簡單，所以具有較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭力和廣闊的發(fā)展前景，因此本文總結(jié)了近年來新發(fā)現(xiàn)的微生物多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制，旨在為微生物多糖資源的開發(fā)和利用提供一定的參考。

1 微生物多糖對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響

1.1 對(duì)NO生成的影響 NO是一種重要的細(xì)胞信號(hào)分子，廣泛參與了機(jī)體多種生理和病理過程，也是一種毒性分子，對(duì)腫瘤細(xì)胞和病原微生物有很強(qiáng)的殺傷作用［6］。在巨噬細(xì)胞中是由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）催化L－精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)長－瓜氨酸而產(chǎn)生［7］。許多微生物來源的多糖都可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO。Chang ZQ等從一種多黏類芽孢桿菌JB115的發(fā)酵液中分離純化獲得一種β－葡聚糖，能夠在30～300μg／ml范圍內(nèi)劑量依賴性的誘導(dǎo)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 NO，在300μg／ml的劑量作用下，所產(chǎn)生的NO濃度是陰性對(duì)照的10倍［8］。Xiao JF等從一種海洋絲狀真菌YS4108的菌絲體中分離純化獲得一種α－葡聚糖YCP，也能夠在50～250μg／ml劑量依賴性的誘導(dǎo) RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO［9］。而一種從香菇子實(shí)體中獲得的β－葡聚糖，可以激活核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB，但卻不能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)iNOS和產(chǎn)生NO，這可能與該多糖刺激NF－κB的P65亞基與另一未知亞基形成復(fù)合物，而無法啟動(dòng)相關(guān)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)［10］。

1.2 對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響 巨噬細(xì)胞可以被選擇性激活，分別極化成為M1（Classically activated macrophage）或 者 M2 （Alternatively activated macrophage），M1細(xì)胞呈現(xiàn)出促炎癥反應(yīng)的能力，維持Th1適應(yīng)性應(yīng)答，能夠分泌促炎癥細(xì)胞因子如IL－1、IL－6、IL－12、TNF－α，并對(duì)病原微生物或者癌細(xì)胞表現(xiàn)出較高的吞噬能力。而M2細(xì)胞呈現(xiàn)出抗炎癥活性。抑制Th1應(yīng)答，促進(jìn)Th2應(yīng)答，能夠分泌抗炎癥細(xì)胞因子（IL－10、TGF－β），產(chǎn)生 Th2細(xì)胞化學(xué)引誘物［11］。目前文獻(xiàn)所報(bào)道微生物來源的多糖多為能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化。Se Eun Byeon等從松茸中分離純化得到一種多糖片段TmC－2，可以在（1、2、4mg／ml）范圍內(nèi)劑量依賴性的誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌 TNF－α，當(dāng)作用劑量為4mg／ml時(shí) TNF－α產(chǎn)量與 LPS（1μg／ml）作用時(shí)相當(dāng)［12］。此外，當(dāng)以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁r(shí)，靈芝孢子多糖GSG可以在50～200μg／ml范圍內(nèi)劑量依 賴 性 的 誘 導(dǎo) 細(xì) 胞 分 泌 TNF－α 和 IL－6［13］。 而Chang lu Wang等從白靈菇中獲得一種水溶性多糖蛋白復(fù)合物PN50G，可以刺激RAW264.7細(xì)胞分泌促炎癥因子TNF－α和IL－6，同時(shí)也能促進(jìn)抗炎癥因子IL－10的分泌，當(dāng)用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建炎癥模型后，用PN50G處理，發(fā)現(xiàn)可以顯著下調(diào) TNF－α、IL－6、IL－10的分泌，這顯示了其具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用［14］。

1.3 對(duì)吞噬活性的影響 吞噬活性是巨噬細(xì)胞展示其免疫防衛(wèi)作用的重要功能，當(dāng)機(jī)體受到病原微生物入侵或機(jī)體出現(xiàn)變異細(xì)胞或細(xì)胞碎片時(shí)，巨噬細(xì)胞可以吞噬和消化這些內(nèi)外源性異物，然后將其遞呈給淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步提升適應(yīng)性免疫應(yīng)答［15］。不少微生物來源的多糖都可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性。Bai Y等從一種南極海洋適冷菌Pseudoaltermonas sp.S－5的發(fā)酵液中分離純化得到一種雜多糖PEP，發(fā)現(xiàn)其在5～200μg／ml范圍內(nèi)可以顯著提升小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬酵母顆粒的能力，在50μg／ml的劑量下吞噬活性最強(qiáng)［16］。Hiroaki Kojima等從香菇子實(shí)體中分離純化得到兩個(gè)多糖片段IA－a和IA－b，使用熒光微球吞噬實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IA－a，IA－b均可顯著增強(qiáng) RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性［17］。一種從細(xì)腳擬青霉中分離純化得到的多糖PtP可以在0.125～0.5mg／ml范圍內(nèi)可以顯著促進(jìn)人單核巨噬細(xì)胞吞噬中性紅，當(dāng)劑量在0.25mg／ml時(shí)吞噬活性最強(qiáng)［18］。

1.4 對(duì)其他功能的影響 用來源于白靈菇的多糖蛋白復(fù)合物PN50G（5～40μg／ml）處理RAW264.7細(xì)胞后于電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該多糖蛋白復(fù)合物可以明顯促使該細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，其中在20μg／ml劑量作用下效果最強(qiáng)，細(xì)胞體積增大，形態(tài)由圓形變?yōu)椴灰?guī)則，并伸出樹突狀偽足，這些形態(tài)變化說明了細(xì)胞的黏附和吞噬活性增強(qiáng)［14］。ROS（Reactive oxygen species）是需氧細(xì)胞在代謝中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄因子的激活方面扮演了重要角色，具有廣泛的生理意義。來源于松茸的多糖片段 TmC－2可以在（1、2、4mg／ml）范圍內(nèi)劑量依賴性的提高RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，而來源于南極海洋適冷菌Pseudoaltermonas sp.S－5發(fā)酵液的雜多糖PEP雖然能夠上調(diào)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫活性，但卻沒有影響ROS的產(chǎn)量，這可能與該多糖無法刺激特定的信號(hào)通路有關(guān)［16］。此外，從細(xì)腳擬青霉中得到的多糖PtP可以明顯提升小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、人單核巨噬細(xì)胞中LDH和ACP的水平，LDH和ACP是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志酶，PtP能夠提升LDH和ACP水平意味著PtP能夠激活這三種不同的巨噬細(xì)胞［18］。

2 微生物多糖激活巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制

近年來隨著研究的不斷深入，人們對(duì)微生物多糖激活巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的研究已經(jīng)達(dá)到分子受體水平，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)微生物多糖可以與巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體 （Pattern recognition receptor，PRR）結(jié)合，繼而啟動(dòng)免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。能夠識(shí)別微生物多糖類的PRR主要有：TLR2，4受體、Dectin－1受體、β－葡聚糖受體、CD14、補(bǔ)體受體3（CR3）［19～22］。微生物多糖與 PRR 的結(jié)合可觸發(fā)下游信號(hào)分子的產(chǎn)生，繼而引發(fā)胞內(nèi)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的激活，誘導(dǎo)相關(guān)免疫基因表達(dá)，激活免疫反應(yīng)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的微生物多糖多是與巨噬細(xì)胞表面TLR受體結(jié)合激活核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB和絲裂原活化蛋白激酶 MAPKS（包括ERK，JNK，和P38）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。例如來源于蟬擬青霉菌絲體的多糖PCP可以通過與巨噬細(xì)胞表面的TLR4受體結(jié)合，激活 MAPKS和NF－κB進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO和分泌細(xì)胞因子。當(dāng)用TLR4siRNA將TLR4基因沉默，用MAPKS和NF－κB的特異性抑制劑處理細(xì)胞后，均可以明顯下調(diào)PCP對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫刺激作用［23］。當(dāng)用 TLR2、TLR4、CR3抗體處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)只有TLR4抗體處理后可以顯著下調(diào)豬苓來源的多糖PPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL－1β和TNF－α，這說明該多糖是與巨噬細(xì)胞表面的TLR4受體結(jié)合而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用［24］。來源于海洋絲狀真菌YS4108的菌絲體的α－葡聚糖YCP可以與巨噬細(xì)胞表面的TLR4和CR3兩種受體結(jié)合，激活P38MAPK，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO［9］而從紫芝發(fā)酵液中分離純化得到一種胞外多糖片段PS－F2，可以與RAW264.7細(xì)胞表面的多種受體（TLR4、CR3、Dectin－1）結(jié)合，激活syk，NF－κB和MAPKS，最終誘導(dǎo) TNF－α的分泌［25］。

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路十分復(fù)雜，且不同通路之間往往相互影響、交互調(diào)控，一種微生物多糖可以同時(shí)與細(xì)胞表面多種受體結(jié)合，在不同水平不同環(huán)節(jié)同時(shí)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路。微生物多糖所具有的免疫活性與其對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響密切相關(guān)，從細(xì)胞水平和分子水平闡明微生物多糖激活巨噬細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)于將具有良好免疫活性的微生物多糖開發(fā)成為新型免疫治療藥物具有重要意義。

3 結(jié)語

微生物來源的多糖因?yàn)榫哂幸咨a(chǎn)、產(chǎn)量高、分離純化簡單等優(yōu)點(diǎn)而具有很高的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)許多微生物來源的多糖都可以通過與巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptor，PRR）結(jié)合，激活胞內(nèi)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能，如促進(jìn)巨噬細(xì)胞成熟，增強(qiáng)其吞噬活性，促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)分子產(chǎn)生和細(xì)胞因子的分泌，達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫力的目的。通過研究微生物多糖激活巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制可以從細(xì)胞水平和分子水平闡明微生物多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制，為今后探尋和開發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)活性的微生物多糖提供參考。

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