代謝組學(xué)分析方法在2型糖尿病中的應(yīng)用研究

肖 繼(綜述)，閆衛(wèi)利(審校)

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，天津 300150)

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等都在生命的探究中取得了重要突破。代謝組學(xué)著重于分析相對分子質(zhì)量<1000的小分子代謝物質(zhì)[1]，在后基因組時代的生命科學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。代謝組學(xué)是以物理學(xué)基本原理為基礎(chǔ)的分析化學(xué)、以數(shù)學(xué)計算與建模為基礎(chǔ)的化學(xué)計量學(xué)和以生物化學(xué)為基礎(chǔ)的生命科學(xué)等多學(xué)科交叉的一門新學(xué)科，它能對生物系統(tǒng)因病理生理或基因改變等刺激所致動態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答的定量測定，是關(guān)于生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其變化規(guī)律的科學(xué)。代謝組學(xué)的中心任務(wù)包括檢測、量化和編錄生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其變化規(guī)律，并且通過這種變化規(guī)律探究所發(fā)生的生物學(xué)事件或過程的本質(zhì)。它是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新近發(fā)展起來的一門學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)[2]重要的組成部分。

1 代謝組學(xué)分析方法

當(dāng)前代謝組學(xué)研究的核心技術(shù)是磁共振技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)?，F(xiàn)有的分析方法基本上可以歸為三類：磁共振波譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法和色譜-核磁-質(zhì)譜聯(lián)用法。

1.1磁共振波譜法 磁共振波譜法(nuclear magnetic resonance，NMR)是利用原子核磁特性的一種波譜分析技術(shù)，分析分子內(nèi)個官能團(tuán)的連接結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性。磁共振技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢：①沒有偏性，對樣品中所有的物質(zhì)靈敏度是一樣的，而質(zhì)譜存在離子化程度和基質(zhì)干擾等問題；②具有無損傷性，可探測化合物內(nèi)部結(jié)構(gòu)而不破壞樣品，樣品不需要繁瑣處理，可在接近生理條件下進(jìn)行實驗，因而便于活體、原位的動態(tài)檢測；③可以進(jìn)行實時和動態(tài)的檢測，可設(shè)計多種編輯手段，實驗方法靈活多樣。NMR氫譜的譜峰與樣品中各化合物的氫原子是一一對應(yīng)的，所測樣品中的每一個氫原子在圖譜中都有其相關(guān)的譜峰，圖譜中信號的相對強(qiáng)弱反映樣品中各組分的相對含量。因此，NMR方法很適合研究代謝產(chǎn)物中的復(fù)雜成分。但它的缺點是檢測靈敏度相對較低，很難同時測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產(chǎn)物。

1.2色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法 (1iquid chromatography-mass spectrometre，LC-MS)技術(shù)已發(fā)展成為代謝組學(xué)研究的主流技術(shù)手段[3]，色譜分析是通過兩相及兩相的相對運(yùn)動對分析物進(jìn)行分離和分析的一種方法。質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法。色質(zhì)聯(lián)用法將色譜儀的分離技術(shù)和質(zhì)譜儀的定性定量鑒定技術(shù)相結(jié)合，是分離和鑒定同時進(jìn)行，總體來說具有良好的客觀性和分辨率，但該方法屬于有偏向的選擇性檢測方法，需要對樣品有介入性和破壞性而不利于在體和原位分析；需要對樣品進(jìn)行較為復(fù)雜的制備而且通量有限；對代謝組中各代謝物的原位定量十分繁瑣，未知代謝物的定性(結(jié)構(gòu)確定)有相當(dāng)?shù)碾y度。

1.3色譜-核磁-質(zhì)譜聯(lián)儀法 該方法以LC-MS和NMR為分析手段，對分析物進(jìn)行平行動態(tài)分析，獲取同一成分內(nèi)在相關(guān)且互補(bǔ)的譜學(xué)信息，可實現(xiàn)復(fù)雜混合物體系組分群無需完全分離的同步分析鑒定[4]。

與構(gòu)成核酸的4種堿基和構(gòu)成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸不同，小分子代謝物的結(jié)構(gòu)種類繁多，理化性質(zhì)差異巨大，含量極微且動態(tài)范圍極寬(7～9數(shù)量級)，時空分布的差異明顯，相互作用方式復(fù)雜，無論定性、定量還是動態(tài)追蹤，目前尚無完善的代謝物擴(kuò)增技術(shù)和分析平臺，因此多種分析平臺方法的聯(lián)合應(yīng)用能夠?qū)Υx物進(jìn)行全面的分析和了解。

2型糖尿病主要是由于胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能衰竭和胰島素分泌障礙等因素引起機(jī)體代謝異常，出現(xiàn)葡萄糖、脂肪和蛋白質(zhì)等代謝紊亂，代謝組學(xué)的應(yīng)用有助于對于糖尿病的具體病因和發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步了解。

2 代謝組學(xué)在葡萄糖代謝機(jī)制的研究

2.1在動物模型的研究 遺傳易患性、環(huán)境因素、精神壓力、胰島素抵抗、生活方式等都與糖尿病的發(fā)病有關(guān)，但確切的發(fā)病機(jī)制仍未明了。而利用糖尿病動物模型進(jìn)行代謝物分析將有利于針對性的病因與發(fā)病機(jī)制研究。目前，國內(nèi)外糖尿病動物模型主要分為實驗性糖尿病動物模型、自發(fā)性糖尿病模型等。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)可以通過自由基損傷β細(xì)胞，使β細(xì)胞功能受損，胰島素合成減少，引發(fā)糖尿病。小鼠多次小劑量注射STZ，可引發(fā)胰腺炎,制成免疫1型糖尿病模型,STZ可能通過細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫，更接近人類的1型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展變化[5]。自發(fā)性動物模型是通過特定的改變動物生存條件，誘導(dǎo)動物自然發(fā)病，與人類某種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程有相似之處。Fearnside等[6]通過對飲食誘導(dǎo)和遺傳基因型的糖尿病動物模型的對比發(fā)現(xiàn)，飲食誘導(dǎo)的動物模型更能反映胰島素抵抗的發(fā)生和糖尿病發(fā)病進(jìn)程。Xu等[7]以瘦素受體基因剔除小鼠為糖尿病模型，取其肝左葉和腎皮質(zhì)后行高分辨率魔角旋壓NMR檢測和代謝組學(xué)分析，結(jié)果顯示，8周齡動物模型的肝組織代謝物變化顯著，其中三酰甘油和膽汁酸升高明顯，三甲胺-N-氧化物、磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿及膽堿明顯降低，但腎皮質(zhì)未見顯著不同。Shear等[8]通過對高脂肪喂養(yǎng)和正常喂養(yǎng)的實驗鼠代謝物核磁共振氫譜分析，結(jié)果顯示高脂肪喂養(yǎng)的白鼠的檸檬酸鹽高于正常白鼠，而甘氨酸、賴氨酸、辛二酸鹽、醋酸鹽、亮氨酸、纈氨酸明顯低于正常白鼠。此外，賴氨酸、甘氨酸、檸檬酸鹽、亮氨酸、辛二酸鹽等降低可能是胰島素抵抗的潛在生物標(biāo)志物。Lin等[9]在對高糖飼養(yǎng)和正常飼養(yǎng)的倉鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)后，進(jìn)行肝臟、骨骼肌和腦組織的MS代謝物分析，發(fā)現(xiàn)胰島素與溶血磷脂膽堿的正向調(diào)節(jié)有關(guān)；高糖飲食能夠增加肝臟和骨骼肌中的氧化應(yīng)激，增高氨基酸的水平和改變脂肪酸生物合成，并且與大腦皮質(zhì)和海馬體中氨基酸水平和嘌呤生物合成的正向調(diào)節(jié)的降低有關(guān)。

2.2在糖代謝途徑中的研究 OGTT是目前公認(rèn)的診斷糖尿病的金標(biāo)準(zhǔn)，通過在空腹?fàn)顟B(tài)下的高糖刺激，檢測機(jī)體對葡萄糖的代謝能力。Shaham等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在OGTT正常人群中，餐后30 min后血漿中甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸顯著升高，機(jī)體在攝入葡萄糖后，膽囊收縮增強(qiáng)，膽汁酸分泌增多，同時膽固醇7α-羥化酶mRNA的表達(dá)也增強(qiáng)，膽固醇7α-羥化酶基因編碼膽固醇代謝過程中重要的限速酶即膽汁酸膽固醇7α-羥化酶。葡萄糖和胰島素對膽固醇7α-羥化酶的表達(dá)提示膽汁酸代謝與葡萄糖的動態(tài)平衡存在著重要關(guān)聯(lián)性[11]。Zhao等[12]對代謝物的研究發(fā)現(xiàn)，糖耐量受損人群血漿中甘氨鵝脫氧膽酸的水平高于正常人群。Kondo等[13]通過給予2型糖尿病患者膽汁酸相關(guān)治療后，發(fā)現(xiàn)葡萄糖和糖化血紅蛋白均有所減低。目前普遍認(rèn)為脂質(zhì)代謝異常所導(dǎo)致的脂肪異常分布，過度堆積是胰島素抵抗的主要原因[14]。Li等[15]利用氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)研究糖尿病患者和正常人的血漿，發(fā)現(xiàn)了葡萄糖等5種生物標(biāo)志物，并提出以非酯化脂肪酸增多為標(biāo)志的脂肪酸代謝異?？赡苁翘悄虿〉闹饕∫?。Matsuzaka等[16]研究小組報道，長鏈脂肪酸家族Elovl6(elongation of long chain fatty acids family member-6)是一種用來催化軟脂酸(C16∶0)轉(zhuǎn)化成硬脂酸(C18∶0)的長鏈脂肪酸延長酶，在胰島素的抵抗中扮演著重要角色。他們的實驗結(jié)果表明，由軟脂酸轉(zhuǎn)化成硬脂酸的過程與胰島素抵抗的發(fā)生息息相關(guān)。Yang等[17]借助代謝組學(xué)方法，通過對血清脂類代謝產(chǎn)物的分析,很好地實現(xiàn)了糖尿病患者與健康對照人群的分離，為糖尿病診斷提供了新的途徑。

3 代謝組學(xué)在臨床糖尿病藥物機(jī)制中的研究

3.1西醫(yī)藥機(jī)制研究 臨床上根據(jù)胰島素發(fā)病機(jī)制，治療糖尿病的藥物分為胰島素及其類似物、雙胍類藥物、磺酰脲類藥物、α葡萄糖甘酶抑制劑等。盡管治療糖尿病的藥物很多，但其作用機(jī)制不同，藥效和不良反應(yīng)也不盡相同。代謝組學(xué)能夠鑒定出患者用藥后小分子物質(zhì)生物化學(xué)變化，從多種代謝通路出發(fā)，構(gòu)建藥物與機(jī)體代謝途徑及病理生理變化的關(guān)系，在藥效評價中充當(dāng)著重要角色。劉躍芹等[18]利用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)方法對阿卡波糖治療2型糖尿病的藥效進(jìn)行代謝組學(xué)分研究，并對衍生化后的尿液進(jìn)行了代謝輪廓分析，推斷出阿卡波糖除具有α葡萄糖苷酶抑制劑的作用外，還能對體內(nèi)的能量代謝通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路及腸道菌群代謝通路途徑產(chǎn)生影響。

Huo等[19]研究了2型糖尿病患者服用二甲雙胍后血清中內(nèi)源性代謝物的變化，篩選出苯丙氨酸和乳酸等生物標(biāo)志物。Bao等[20]利用基于氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)方法，分析了2型糖尿病患者服用瑞格列奈、二甲雙胍、羅格列酮之后血清代謝水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)服用這三種降糖藥的患者都能顯著下調(diào)血清中谷氨酸鹽的水平，羅格列酮治療組能夠?qū)⒏喈惓４x的化合物調(diào)到正常水平，提示羅格列酮治療2型糖尿較其他兩者更有效。

3.2中醫(yī)藥機(jī)制研究 中醫(yī)藥治療糖尿病及其并發(fā)癥具有悠久歷史和不可替代的優(yōu)勢。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人是一個有機(jī)的整體。構(gòu)成人體的各個組成部分之間在結(jié)構(gòu)上不可分割，在功能上相互協(xié)調(diào)，在病理上相互影響。但由于中藥成分復(fù)雜以及用藥方式多樣，顯然僅以中醫(yī)理論進(jìn)行其藥理的機(jī)制闡述已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代科學(xué)對疾病治療的要求，也限制了中醫(yī)藥的自身發(fā)展。代謝組學(xué)通過對研究對象進(jìn)行高通量的分析，以“代謝指紋圖譜”變化闡明中藥有效成分和作用靶標(biāo)，從而真正闡明中藥的作用機(jī)制。王靜等[21]采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)研究黃連治療2型糖尿病的機(jī)制，結(jié)果表明黃連不僅具有降糖和降血脂的作用，而且具有抗氧化作用。GU等[22]應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)考察了小檗堿治療2型糖尿病的潛在機(jī)制，結(jié)果顯示，給藥后糖尿病志愿者組血清中13種非酯化脂肪酸水平減少，其中10種有統(tǒng)計學(xué)意義，提示小檗堿可能是通過下調(diào)高水平的非酯化脂肪酸來發(fā)揮其治療作用。

4 小 結(jié)

目前，代謝組學(xué)作為一門多學(xué)科交叉的新學(xué)科，其檢測技術(shù)、實驗性研究及臨床應(yīng)用中均取得了一定進(jìn)展。但是研究平臺間存在的差異以及生物標(biāo)本的復(fù)雜性和現(xiàn)階段分析技術(shù)的局限性，制約人們能從標(biāo)本中分析出代謝物的程度，從而限制了代謝組學(xué)的發(fā)展。如何通過多分析平臺的互補(bǔ)作用與其他組學(xué)結(jié)合，充分利用代謝組學(xué)的優(yōu)勢全面理解疾病的精確生物學(xué)過程仍需要不斷探索。

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