肝細(xì)胞生長因子和低氧誘導(dǎo)因子1修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用研究進(jìn)展

王 博(綜述)，哈小琴(審校)

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院檢驗科，蘭州 730050)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC) 因其移植后免疫耐受性以及向炎癥、損傷組織、腫瘤部位歸巢的趨化特性，成為一種理想的組織工程種子細(xì)胞和基因工程載體，在缺陷性疾病、退行性疾病、遺傳性疾病以及多種組織創(chuàng)傷修復(fù)的治療中均具有廣闊的應(yīng)用前景。肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)具有廣泛的組織修復(fù)功能，而低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor,HIF-1)在缺氧缺血狀態(tài)下也具有保護(hù)作用。該文就HGF和HIF-1的生物活性及修飾MSC的研究現(xiàn)狀及前景進(jìn)行綜述。

1 MSC的生物學(xué)特點

MSC源于中胚層，但存在于全身各結(jié)締組織與器官的間質(zhì)中，具有跨胚層分化潛能的成體干細(xì)胞，在骨髓中含量最豐富，MSC起支持和誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化的作用。雖然不同組織來源的MSC具有相似的生物學(xué)特點和表型，但是它們的分化潛能以及對來源組織的基因表達(dá)的影響方式有所不同。MSC具有以下幾個生物學(xué)特點。

1.1多向分化潛能 MSC不但可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等同胚層細(xì)胞，而且還可跨胚層分化為外胚層的神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與內(nèi)胚層的肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。MSC的多向分化潛能是其治療學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)?？偟膩碚f，有兩種方法可用于調(diào)控MSC的分化[1]：一種為基因工程技術(shù)，通過過表達(dá)種系特異性轉(zhuǎn)錄因子來誘導(dǎo)種系特異性的MSC分化。另一種方法是通過“微環(huán)境”調(diào)控，因為MSC種系特異性的分化有賴于細(xì)胞接收到的微環(huán)境信號。在該途徑中，可往MSC培養(yǎng)液中加入各種不同的生長因子、激素、細(xì)胞外基質(zhì)成分等混合培養(yǎng)來誘導(dǎo)其分化。

1.2組成成分的生化不均一性 MSC各成分存在的生化不均一性反映了骨髓中基質(zhì)系統(tǒng)的復(fù)雜性和他們調(diào)節(jié)組織內(nèi)環(huán)境的多種不同功能，同時，這種異質(zhì)性也顯著影響了MSC在體內(nèi)的效力。體外擴(kuò)增MSC成分的不同方法可顯著影響其最終的總成分構(gòu)成，所以不同實驗室得出的結(jié)果各不相同。其次，由于亞細(xì)胞成分各異，利用純化細(xì)胞治療特異性疾病存在一定的瓶頸，因此對純化方法的研究和更新，是目前干細(xì)胞治療應(yīng)用中亟待解決的問題[2]。

1.3表面抗原的非專一性/免疫表型 用流式細(xì)胞儀檢測[3]，MSC表面表達(dá)CD29、CD73、CD90、CD105、CD106、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素7和白細(xì)胞介素8等；MSC的免疫表型為主要組織相容性抗原(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ(+)、MHC-Ⅱ(-)、CD40-、CD80-和CD86-。

1.4移植后免疫耐受性 MSC具有雙峰性的免疫特性，既可發(fā)揮免疫抑制作用，也可發(fā)揮免疫增強作用。通過MSC介導(dǎo)的免疫抑制作用可治療某些自身免疫性疾病，免疫刺激作用則可限制腫瘤的擴(kuò)散。MSC的免疫表型為MHC-Ⅰ(+)，MHC-Ⅱ(-)，同時對于CD40、CD80、CD86等共刺激因子來說也是陰性的，因此MSC被認(rèn)為幾乎無免疫原性[4]。MHC-Ⅰ也可激活T細(xì)胞，但是在缺乏共刺激因子的情況下，無法與第二信號通路連接，從而使T細(xì)胞無反應(yīng)性。已有研究表明，MSC具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的功能，因此MSC有望成為治療移植物抗宿主疾病和調(diào)節(jié)炎癥的有效工具之一[5]。同種異體移植的MSC不會發(fā)生排斥，并且在沒有使用免疫抑制劑的情況下可以在多種不同的組織內(nèi)長期存活[6]。利用MSC具有向炎癥、損傷組織器官、腫瘤部位趨化等特性，目前MSC的臨床應(yīng)用主要有[5]：①再生治療；②治療移植物抗宿主反應(yīng)和克羅恩?。虎圩鳛榘┌Y基因治療的平臺/載體。此外，MSC作為抗癌藥物靶向傳輸?shù)妮d體，也越來越多地被應(yīng)用于癌癥的基因治療研究。

2 HGF與MSC

2.1HGF的結(jié)構(gòu)與功能 HGF是一個異二聚體，由相對分子質(zhì)量為69×103的大亞基(重鏈)和一個相對分子質(zhì)量為×103的小亞基(輕鏈)構(gòu)成。HGF重鏈與輕鏈的氨基酸序列現(xiàn)已明確。HGF重鏈的結(jié)構(gòu)包括4個Kringle結(jié)構(gòu)，Kringle結(jié)構(gòu)由3個二硫鍵連接而成的雙環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)，其中特征性序列(Asn_Tyr_Cys_Arg_Asn_Pro_Asp)只存在于Kringle結(jié)構(gòu)中，HGF中的Kringle結(jié)構(gòu)與纖溶酶原和凝血酶中的Kringle結(jié)構(gòu)相似，但與HGF功能的關(guān)系目前還不明確；HGF的輕鏈結(jié)構(gòu)和絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)類似，但是迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)HGF具有蛋白酶的功能。HGF輕鏈蛋白序列與散射因子都具有同源性，這與HGF的細(xì)胞運動作用相關(guān)[7]。HGF是一類作用廣泛的細(xì)胞因子，除了對肝細(xì)胞的作用外，還對很多組織和細(xì)胞有調(diào)控作用，它可以啟動肝再生、促進(jìn)細(xì)胞分裂，對某些癌及肉瘤細(xì)胞具有抑制作用和腫瘤壞死作用[8]。

2.2HGF修飾的MSC的功能 HGF修飾骨髓MSC，可以抑制骨髓MSC凋亡，能提高細(xì)胞存活率，但是骨髓MSC也是HGF基因理想的細(xì)胞表達(dá)載體[9]。HGF修飾的MSC不會影響干細(xì)胞的分化功能，研究發(fā)現(xiàn)，HGF轉(zhuǎn)染骨髓MSC不會影響MSC的生長及與向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化能力，但對細(xì)胞增殖和成骨也沒有明顯促進(jìn)作用[10]。此外，HGF修飾的MSC具有免疫抑制作用，將會提高移植的成功率。朱金海等[11]發(fā)現(xiàn)，使用HGF修飾的骨髓MSC，在肝移植中，肝的局部會出現(xiàn)高濃度的HGF免疫抑制微環(huán)境，它能更加顯著地抑制急性排斥反應(yīng)，延長移植受體的存活時間。研究表明，HGF-MSC還可以加強對經(jīng)修飾的NIH3T3細(xì)胞與NIH3T3細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用和CD11b陽性或陰性細(xì)胞的活性，與BMSCs的免疫抑制作用類似，可以對細(xì)胞移植與組織損傷產(chǎn)生有益的作用。

近年來，MSC-HGF對于機體功能重建越來越受到關(guān)注。在心臟功能方面，MSC-HGF能夠更好地改善心肌病心力衰竭大鼠的左心室重構(gòu)，可以增強單純MSC對心肌梗死大鼠的治療作用，同時還可以明顯改善大鼠的心肌纖維化狀況[12-13]。在燒傷創(chuàng)面方面發(fā)現(xiàn)，MSC-HGF移植通過分泌相關(guān)細(xì)胞因子，能促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的愈合，對其具有積極影響[14]。在骨損傷方面，MSC-HGF因其更強的抗低氧損傷能力，可以增強血管的再生和骨重建，是潛在的治療骨壞死的有效途徑[15-16]。

3 HIF-1與MSC

3.1HIF-1結(jié)構(gòu)和功能 HIF-1是在低氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞的核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，它能與人紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)基因3′端增強子的寡核甘酸序列發(fā)生特異性結(jié)合，并促進(jìn)EPO轉(zhuǎn)錄 ，首次將其命名為HIF-1[17]。HIF-1是異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由 HIF-1α和 HIF-1β兩個亞單位組成，兩個基本的螺旋-環(huán)-螺旋單元(bHLH)PAS(Per-AhR/ARNT-Sim)區(qū)域蛋白相對分子質(zhì)量分別為120×103和 91×103。HIF-1廣泛存在于細(xì)胞中參與低氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個主要的轉(zhuǎn)錄因子[18-19]。

HIF-1在維系腫瘤血運及供能方面起到關(guān)鍵的作用，不但可以誘導(dǎo)糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)來改變細(xì)胞代謝途徑，而且還可以誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)來改善局部微循環(huán)[20]。當(dāng)細(xì)胞處于低氧環(huán)境時，HIF-1α的泛素降解途徑將被破壞，從而與HIF-1β二聚化形成穩(wěn)定的HIF-1分子，轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核內(nèi)，它通過與低氧反應(yīng)元件的結(jié)合調(diào)控多種分子的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管新生、糖酵解和凋亡抵抗[21]。Nardinocchi等[22]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HIF-1α活性受到同源結(jié)構(gòu)域蛋白激酶2抑制時，化療抵抗腫瘤細(xì)胞可被致敏并出現(xiàn)凋亡。

3.2HIF-1修飾的MSC 低氧預(yù)處理的MSC凋亡率將降低，它對組織損傷的修復(fù)能力將會增強[23]。Weil等[24]研究表明，低氧處理后的MSC治療損傷的胎兒腸上皮細(xì)胞時，將會增加損傷組織的增殖與生存能力。低氧培養(yǎng)也將會縮短細(xì)胞擴(kuò)增時間，增加Sca-1+/CD44+表達(dá)，降低其分化能力[25]。目前，MSC用于治療缺血性疾病，治療效果不佳的瓶頸是移植后細(xì)胞的活性降低。其中，細(xì)胞的黏附性就是其生存的前提，其全部過程包括MSC黏附在內(nèi)皮細(xì)胞，破壞其內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接使細(xì)胞裂開，細(xì)胞則通過裂口穿過其血管壁，到達(dá)缺血組織[26]。Song等[27]研究表明，在低氧條件下可提高M(jìn)SC在心肌缺血性疾病中的黏附性。在血管形成的過程中，血管生成素、Ephrin、轉(zhuǎn)錄生長因子β、血小板源性生長因子與成纖維細(xì)胞生長因子將參與脈管系統(tǒng)的建立[28]。當(dāng)然也有學(xué)者認(rèn)為，在缺氧條件下MSC將通過HIF-1增加血管生成素1與血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)來促進(jìn)血管生成[29]。血管內(nèi)皮生長因子是強有力的特異性內(nèi)皮細(xì)胞分裂素，它的作用包括血管的再生，增加毛細(xì)血管的增殖及通透能力，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入低氧組織以及無血管區(qū)域直接參與血管生成和增殖[30-31]。所以，HIF-1修飾的MSC將有效改善干細(xì)胞移植的缺點，促進(jìn)增殖，降低凋亡、促進(jìn)血管生成，同時提高細(xì)胞黏附能力。

4 結(jié) 語

鑒于HGF、HIF-1與MSC的密切關(guān)系，可以考慮將兩者聯(lián)合應(yīng)用。如在心肌缺血性疾病中，HGF可以增強單純MSC對心肌梗死大鼠的治療作用，同時還可以顯著改善大鼠的心肌纖維化狀況；而低氧環(huán)境下又可提高M(jìn)SC在心肌缺血性疾病中的黏附性。因此，應(yīng)用HGF和HIF-1聯(lián)合修飾MSC聚集了HGF的廣泛修復(fù)功能、HIF-1的缺氧缺血保護(hù)功能以及MSC自身多向分化潛能及無免疫原性優(yōu)勢，在高原高寒環(huán)境中的再生治療、器官移植中具有廣泛的應(yīng)用前景。

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