生長阻滯和DNA損傷誘導蛋白45α在心血管疾病中的研究進展

葉雨佳(綜述)，倪銳志，孟照輝(審校)

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 分子心血管病研究室，昆明 650032)

生長阻滯和DNA損傷誘導基因(growth arrest and DNA damage-inducible,GADD)45家族由GADD45α、GADD45β、GADD45γ組成，家族成員分別編碼GADD45α、GADD45β和GADD45γ蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量小(18.3×103)、進化保守(真核生物間有55%～57%氨基酸序列相同)、高度酸性(pH=4.0～4.2)、主要分布于細胞核內(nèi)[1]。GADD45與涉及細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復等功能的生物大分子相互作用，在細胞增殖、衰老、凋亡等生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

1 GADD45α基因及蛋白質(zhì)特征

GADD45α又稱為DNA損傷誘導基因，是抑癌基因p53和乳腺癌易患基因1的下游靶基因，1988年由Fornace等[2]使用消減雜交篩選的方法，從紫外線照射后的中國倉鼠卵巢細胞中克隆出GADD45α的互補DNA序列。人GADD45α位于1p31.2～p31.1，全長3278 bp，含4個外顯子，信使RNA全長1355 bp,編碼序列全長498 bp。GADD45α編碼的蛋白質(zhì)是核糖體蛋白L7Ae家族中的一員，是核糖核蛋白顆粒的一個組成部分[3]。GADD45α由165個氨基酸組成，等電點4.36，相對分子質(zhì)量18.3×103，主要分布于細胞核，也可以在胞質(zhì)中出現(xiàn)[4-5]。

2 GADD45α的表達與調(diào)控

GADD45α在多種損傷因素，如紫外線照射、電離輻射、甲基甲磺酸、烷化劑、營養(yǎng)缺失、二甲基苯蒽、化療藥物等作用下表達迅速上調(diào)，其誘導表達受到多個層次的精確調(diào)節(jié)。①轉(zhuǎn)錄水平：p53結(jié)合于GADD45α的第三個內(nèi)含子中的p53基序上，直接促進GADD45α的轉(zhuǎn)錄表達[6]；核轉(zhuǎn)錄因子Wilms瘤基因1(Wilms′tumor gene 1，WT1)與GADD45α啟動子上的WT1基序結(jié)合，p53通過與WT1的相互作用間接調(diào)控GADD45α的轉(zhuǎn)錄[7]。轉(zhuǎn)錄因子乳腺癌易患基因1、有機陽離子轉(zhuǎn)運體1、核因子FA(nuclear factor-YA，NF-YA)等也可與GADD45α的啟動子區(qū)域結(jié)合，通過p53非依賴的方式調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄[8]。②轉(zhuǎn)錄后水平：甲基甲磺酸可以解離結(jié)合于GADD45α的3′非編碼區(qū)的不均一RNA核糖核蛋白D和T細胞凋亡抑制相關(guān)蛋白，從而提高GADD45α信使RNA的穩(wěn)定性[9]。③翻譯水平：GADD45α的表達與其信使RNA 5′非編碼區(qū)內(nèi)特殊序列介導的非戴帽機制相關(guān)[10]。④翻譯后水平：砷可以抑制小鼠胚胎成纖維細胞核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)介導的泛素化蛋白酶降解GADD45α，從而提高GADD45α的表達[11]。

3 GADD45α的生物學作用

GADD45Α參與調(diào)控基因組的穩(wěn)定性、細胞周期行進、DNA修復、細胞凋亡等多種生物學過程。GADD45α與Aurora-A激酶相互作用，有效抑制Aurora-A激酶介導的中心體擴增，從而維持基因組的穩(wěn)定性[12]。GADD45α的中心區(qū)域(Asp65～Glu84)可介導周期蛋白依賴性蛋白激酶2/周期蛋白B1復合物解聚，導致細胞喪失周期蛋白依賴性蛋白激酶的活性，細胞被阻滯在G2/M期[13]。近期研究發(fā)現(xiàn)，GADD45α可通過活化的c-Jun氨基端激酶，使細胞阻滯在G2/M及G1期[14-15]。c-Jun氨基端激酶作為GADD45α介導凋亡反應的主要下游靶分子，可在轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)作用下激活后活化胱天蛋白酶3依賴的凋亡調(diào)節(jié)通路[16]。GADD45α可通過調(diào)控β聯(lián)蛋白/上皮鈣黏素復合物的穩(wěn)定性及下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲[17]。

GADD45α不僅可與增殖細胞核抗原、p21結(jié)合調(diào)節(jié)DNA損傷修復，近期研究發(fā)現(xiàn)，還可以啟動DNA主動去甲基化，調(diào)節(jié)DNA切除修復。腫瘤源性黏附因子12作用下，GADD45α聚集于核糖體DNA的啟動子上并除去核糖體DNA啟動子上甲基化的胸腺嘧啶，促進DNA核苷酸切除修復[18]。GADD45α與活化誘導胞嘧啶核苷脫氨酶及胸腺嘧啶糖苷酶結(jié)合，調(diào)節(jié)DNA堿基切除修復[19-20]。GADD45α也可與GADD45β、GADD45γ或自身重組形成寡聚體，共同調(diào)節(jié)GADD45介導的多種損傷因素刺激引起的DNA損傷修復、細胞凋亡等生物學過程。

4 GADD45α與心血管疾病

4.1GADD45α與心室重構(gòu)

4.1.1GADD45α與心肌梗死后的心室重構(gòu) 缺血缺氧時心肌細胞內(nèi)活性氧自由基蓄積所致的氧化損傷是心肌損傷的重要原因。心肌細胞氧化損傷可致心肌細胞死亡，繼而發(fā)生心肌纖維化、肥大，心室腔擴大，心功能下降，最終導致心力衰竭。Edwards等[21]將小鼠按照年齡大小分為5個月、15個月、25個月組，在每組小鼠腹腔內(nèi)注射一定量的劇毒藥物百草枯，使機體產(chǎn)生大量的氧自由基，百草枯及氧自由基隨血液流動，到達心肌細胞內(nèi)，對心肌細胞產(chǎn)生不同程度的破壞，從而建立氧化應激模型，使用基因芯片技術(shù)檢測百草枯注射后不同時間小鼠心肌細胞內(nèi)基因表達情況，結(jié)果顯示5個月的幼年小鼠在注射百草枯3 h后，GADD45α及絲裂原活化蛋白激酶6等介導DNA損傷修復的基因表達水平顯著上調(diào)。作為forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族(forkhead transcription factor O family，F(xiàn)OXO)介導的DNA修復的下游靶分子，GADD45α可與FOXO3a共同調(diào)控心肌細胞DNA的損傷修復[22]。Sengupta等[23]將實驗大鼠的冠狀動脈左前降支結(jié)扎，制作心肌梗死模型，采用基因敲除、定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應、蛋白質(zhì)印跡及組織學分析等方法研究FOXO轉(zhuǎn)錄因子促進氧化應激損傷后心肌細胞存活的機制，結(jié)果顯示與未剔除FOXO1和FOXO3的心肌細胞相比，基因敲除的大鼠心肌細胞梗死面積擴大，心肌纖維化程度增加，DNA損傷修復蛋白GADD45α與具有抗氧化作用的過氧化氫酶、錳超氧化物歧化酶在基因及蛋白質(zhì)水平表達均顯著下調(diào)。這些研究表明，GADD45α在調(diào)節(jié)氧化應激刺激下的心肌細胞DNA修復過程中發(fā)揮一定的作用。

4.1.2GADD45α與高血壓左心室肥厚 高血壓左心室肥厚是指由于高血壓導致左心室重量增加,病理表現(xiàn)為心室壁的增厚及心肌重量的增加和以心肌細胞肥大、心肌纖維化為主的心室重構(gòu)，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、猝死、腦卒中等事件的獨立危險因素。Rys?等[24]將實驗大鼠分為三組，其中兩組為實驗組，分別注射精氨酸加壓素或血管緊張素Ⅱ，第三組為對照組注射生理鹽水；使實驗組大鼠血壓升高至160 mm Hg，通過基因芯片技術(shù)檢測大鼠左心室心肌細胞內(nèi)基因的表達情況，結(jié)果顯示精氨酸加壓素、血管緊張素Ⅱ均可使DNA損傷修復基因GADD45α及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-x表達上調(diào)。使用血管緊張素受體1拮抗劑氯沙坦阻斷血管緊張素Ⅱ作用6 h后，使用蛋白質(zhì)印跡方法檢測GADD45α及Bcl-x的表達情況，結(jié)果顯示Bcl-x的表達量較之前下降了40%，而GADD45α則下降至陰性對照組水平。González等[25]選取冠狀動脈造影正常的28例原發(fā)性高血壓患者作為試驗組，8例尸檢正常的心肌組織作為對照組，將試驗組隨機分為兩組，分別使用氯沙坦、氨氯地平降壓治療1年，治療前、后使用經(jīng)靜脈心內(nèi)膜心肌活檢技術(shù)取患者心臟室間隔中部心肌組織，采用末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)檢測心肌細胞凋亡水平，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓患者心肌細胞凋亡指數(shù)較正常心肌組織顯著升高，降壓治療后，氯沙坦治療組心肌細胞凋亡指數(shù)較治療前顯著下降，而氨氯地平治療組的心肌細胞凋亡指數(shù)較治療前無明顯變化。由此推斷，GADD45α可能在血管緊張素Ⅱ介導的壓力超負荷引起的左室心肌肥厚中發(fā)揮重要的作用。

4.2GADD45α與動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化發(fā)病機制復雜且嚴重危害人類健康。在長期的高脂血癥情況下，增高的氧化低密度脂蛋白通過特異性內(nèi)皮細胞表面的植物血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1介導的內(nèi)皮毒性對動脈內(nèi)膜造成功能性損傷，被認為是動脈粥樣硬化的危險因素。Thum等[26]用蛋白質(zhì)印跡、半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法發(fā)現(xiàn)植物血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1、GADD45α在主動脈粥樣硬化組織中表達明顯上調(diào)，對相關(guān)機制研究發(fā)現(xiàn)，人主動脈內(nèi)皮細胞受氧化低密度脂蛋白刺激致氧化DNA損傷時，有機陽離子轉(zhuǎn)運體1、GADD45α的表達顯著增高，導致冠狀動脈內(nèi)皮細胞代謝異常。由此推斷，GADD45α可能在氧化低密度脂蛋白引起的內(nèi)皮損傷中發(fā)揮一定的作用。

Dancu等[27]報道了血流動力學的改變會影響內(nèi)皮細胞功能，可能與動脈粥樣硬化形成有關(guān)。在人體內(nèi)動脈粥樣硬化最顯著的地方，如冠狀動脈和頸內(nèi)動脈分支外側(cè)壁，流體對血管壁的剪應力相對較低，流體剪應力與固體牽張力最不同步[28]。Lin等[29]將牛主動脈內(nèi)皮細胞置于不同剪應力的層流中剪切，用免疫共沉淀、蛋白質(zhì)印跡、熒光素酶報告基因法、RNA干擾、基因突變等研究層流剪應力影響內(nèi)皮細胞生長的機制，結(jié)果顯示當牛主動脈內(nèi)皮細胞在剪應力為1.2 N/m2的層流中剪切30 min后便發(fā)現(xiàn)p53磷酸化，24 h后GADD45α及周期蛋白依賴激酶抑制因子p21Cip1的表達顯著升高，最終細胞周期依賴性激酶活性及視網(wǎng)膜母細胞瘤基因磷酸化作用受抑，從而抑制細胞增殖。使用RNA干擾抑制p53轉(zhuǎn)錄活性、突變WT1位點可以有效抑制層流剪切應力誘導的GADD45α啟動子的活性。這些研究表明，在持續(xù)的高層流剪切力作用下，GADD45α以p53依賴的方式表達上調(diào)，并可能在調(diào)控細胞周期行進、加強DNA修復及避免細胞大量增殖及凋亡中發(fā)揮重要的作用。

4.3GADD45α與心臟瓣膜病 心臟瓣膜病是多種原因引起的單個或多個瓣膜結(jié)構(gòu)的功能或結(jié)構(gòu)異常。胚胎時期，心臟瓣膜的發(fā)育異常與心臟瓣膜病密切相關(guān)。堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(basic helix-loop-helix transcription factor 1，TWIST1)在胚胎時期瓣膜發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[30]。Lee等[31]采用染色體免疫共沉淀、原位雜交、RNA干擾等技術(shù)研究正常小鼠胚胎瓣膜中基因的表達及作用機制，發(fā)現(xiàn)GADD45α是TWIST1的靶基因，其內(nèi)含有保守的E-box序列，TWIST1結(jié)合在這一區(qū)域與GADD45α發(fā)揮調(diào)節(jié)心臟瓣膜間質(zhì)細胞的增殖與遷移、細胞外基質(zhì)的合成等作用。

5 結(jié)語與展望

在多種損傷因素刺激下，GADD45α參與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展，并與多種生物大分子相互作用形成一個關(guān)系緊密而復雜的網(wǎng)絡，例如與Aurora-A、周期蛋白依賴性蛋白激酶2/周期蛋白B1、增殖細胞核抗原、p21、c-Jun氨基端激酶及GADD45β、GADD45γ相互作用，在維持基因組的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)細胞周期行進、DNA修復、細胞凋亡等生物學過程中發(fā)揮重要的功能。闡明GADD45α的功能及其在疾病中的作用機制，有助于為多種疾病建立更加有效的診斷方法及更安全的治療方案提供思路和途徑。但GADD45α具有多樣的生物學功能，明確具體作用機制仍需進一步研究。

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