生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白45α在心血管疾病中的研究進(jìn)展

葉雨佳(綜述)，倪銳志，孟照輝(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 分子心血管病研究室，昆明 650032)

生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因(growth arrest and DNA damage-inducible,GADD)45家族由GADD45α、GADD45β、GADD45γ組成，家族成員分別編碼GADD45α、GADD45β和GADD45γ蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量小(18.3×103)、進(jìn)化保守(真核生物間有55%～57%氨基酸序列相同)、高度酸性(pH=4.0～4.2)、主要分布于細(xì)胞核內(nèi)[1]。GADD45與涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等功能的生物大分子相互作用，在細(xì)胞增殖、衰老、凋亡等生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

1 GADD45α基因及蛋白質(zhì)特征

GADD45α又稱為DNA損傷誘導(dǎo)基因，是抑癌基因p53和乳腺癌易患基因1的下游靶基因，1988年由Fornace等[2]使用消減雜交篩選的方法，從紫外線照射后的中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞中克隆出GADD45α的互補(bǔ)DNA序列。人GADD45α位于1p31.2～p31.1，全長(zhǎng)3278 bp，含4個(gè)外顯子，信使RNA全長(zhǎng)1355 bp,編碼序列全長(zhǎng)498 bp。GADD45α編碼的蛋白質(zhì)是核糖體蛋白L7Ae家族中的一員，是核糖核蛋白顆粒的一個(gè)組成部分[3]。GADD45α由165個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)4.36，相對(duì)分子質(zhì)量18.3×103，主要分布于細(xì)胞核，也可以在胞質(zhì)中出現(xiàn)[4-5]。

2 GADD45α的表達(dá)與調(diào)控

GADD45α在多種損傷因素，如紫外線照射、電離輻射、甲基甲磺酸、烷化劑、營(yíng)養(yǎng)缺失、二甲基苯蒽、化療藥物等作用下表達(dá)迅速上調(diào)，其誘導(dǎo)表達(dá)受到多個(gè)層次的精確調(diào)節(jié)。①轉(zhuǎn)錄水平：p53結(jié)合于GADD45α的第三個(gè)內(nèi)含子中的p53基序上，直接促進(jìn)GADD45α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[6]；核轉(zhuǎn)錄因子Wilms瘤基因1(Wilms′tumor gene 1，WT1)與GADD45α啟動(dòng)子上的WT1基序結(jié)合，p53通過與WT1的相互作用間接調(diào)控GADD45α的轉(zhuǎn)錄[7]。轉(zhuǎn)錄因子乳腺癌易患基因1、有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1、核因子FA(nuclear factor-YA，NF-YA)等也可與GADD45α的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，通過p53非依賴的方式調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄[8]。②轉(zhuǎn)錄后水平：甲基甲磺酸可以解離結(jié)合于GADD45α的3′非編碼區(qū)的不均一RNA核糖核蛋白D和T細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)蛋白，從而提高GADD45α信使RNA的穩(wěn)定性[9]。③翻譯水平：GADD45α的表達(dá)與其信使RNA 5′非編碼區(qū)內(nèi)特殊序列介導(dǎo)的非戴帽機(jī)制相關(guān)[10]。④翻譯后水平：砷可以抑制小鼠胚胎成纖維細(xì)胞核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)介導(dǎo)的泛素化蛋白酶降解GADD45α，從而提高GADD45α的表達(dá)[11]。

3 GADD45α的生物學(xué)作用

GADD45Α參與調(diào)控基因組的穩(wěn)定性、細(xì)胞周期行進(jìn)、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)過程。GADD45α與Aurora-A激酶相互作用，有效抑制Aurora-A激酶介導(dǎo)的中心體擴(kuò)增，從而維持基因組的穩(wěn)定性[12]。GADD45α的中心區(qū)域(Asp65～Glu84)可介導(dǎo)周期蛋白依賴性蛋白激酶2/周期蛋白B1復(fù)合物解聚，導(dǎo)致細(xì)胞喪失周期蛋白依賴性蛋白激酶的活性，細(xì)胞被阻滯在G2/M期[13]。近期研究發(fā)現(xiàn)，GADD45α可通過活化的c-Jun氨基端激酶，使細(xì)胞阻滯在G2/M及G1期[14-15]。c-Jun氨基端激酶作為GADD45α介導(dǎo)凋亡反應(yīng)的主要下游靶分子，可在轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)作用下激活后活化胱天蛋白酶3依賴的凋亡調(diào)節(jié)通路[16]。GADD45α可通過調(diào)控β聯(lián)蛋白/上皮鈣黏素復(fù)合物的穩(wěn)定性及下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。

GADD45α不僅可與增殖細(xì)胞核抗原、p21結(jié)合調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)，近期研究發(fā)現(xiàn)，還可以啟動(dòng)DNA主動(dòng)去甲基化，調(diào)節(jié)DNA切除修復(fù)。腫瘤源性黏附因子12作用下，GADD45α聚集于核糖體DNA的啟動(dòng)子上并除去核糖體DNA啟動(dòng)子上甲基化的胸腺嘧啶，促進(jìn)DNA核苷酸切除修復(fù)[18]。GADD45α與活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶及胸腺嘧啶糖苷酶結(jié)合，調(diào)節(jié)DNA堿基切除修復(fù)[19-20]。GADD45α也可與GADD45β、GADD45γ或自身重組形成寡聚體，共同調(diào)節(jié)GADD45介導(dǎo)的多種損傷因素刺激引起的DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程。

4 GADD45α與心血管疾病

4.1GADD45α與心室重構(gòu)

4.1.1GADD45α與心肌梗死后的心室重構(gòu) 缺血缺氧時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基蓄積所致的氧化損傷是心肌損傷的重要原因。心肌細(xì)胞氧化損傷可致心肌細(xì)胞死亡，繼而發(fā)生心肌纖維化、肥大，心室腔擴(kuò)大，心功能下降，最終導(dǎo)致心力衰竭。Edwards等[21]將小鼠按照年齡大小分為5個(gè)月、15個(gè)月、25個(gè)月組，在每組小鼠腹腔內(nèi)注射一定量的劇毒藥物百草枯，使機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基，百草枯及氧自由基隨血液流動(dòng)，到達(dá)心肌細(xì)胞內(nèi)，對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的破壞，從而建立氧化應(yīng)激模型，使用基因芯片技術(shù)檢測(cè)百草枯注射后不同時(shí)間小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示5個(gè)月的幼年小鼠在注射百草枯3 h后，GADD45α及絲裂原活化蛋白激酶6等介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)的基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。作為forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族(forkhead transcription factor O family，F(xiàn)OXO)介導(dǎo)的DNA修復(fù)的下游靶分子，GADD45α可與FOXO3a共同調(diào)控心肌細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)[22]。Sengupta等[23]將實(shí)驗(yàn)大鼠的冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎，制作心肌梗死模型，采用基因敲除、定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白質(zhì)印跡及組織學(xué)分析等方法研究FOXO轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)氧化應(yīng)激損傷后心肌細(xì)胞存活的機(jī)制，結(jié)果顯示與未剔除FOXO1和FOXO3的心肌細(xì)胞相比，基因敲除的大鼠心肌細(xì)胞梗死面積擴(kuò)大，心肌纖維化程度增加，DNA損傷修復(fù)蛋白GADD45α與具有抗氧化作用的過氧化氫酶、錳超氧化物歧化酶在基因及蛋白質(zhì)水平表達(dá)均顯著下調(diào)。這些研究表明，GADD45α在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激刺激下的心肌細(xì)胞DNA修復(fù)過程中發(fā)揮一定的作用。

4.1.2GADD45α與高血壓左心室肥厚 高血壓左心室肥厚是指由于高血壓導(dǎo)致左心室重量增加,病理表現(xiàn)為心室壁的增厚及心肌重量的增加和以心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化為主的心室重構(gòu)，是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、猝死、腦卒中等事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Rys?等[24]將實(shí)驗(yàn)大鼠分為三組，其中兩組為實(shí)驗(yàn)組，分別注射精氨酸加壓素或血管緊張素Ⅱ，第三組為對(duì)照組注射生理鹽水；使實(shí)驗(yàn)組大鼠血壓升高至160 mm Hg，通過基因芯片技術(shù)檢測(cè)大鼠左心室心肌細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示精氨酸加壓素、血管緊張素Ⅱ均可使DNA損傷修復(fù)基因GADD45α及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-x表達(dá)上調(diào)。使用血管緊張素受體1拮抗劑氯沙坦阻斷血管緊張素Ⅱ作用6 h后，使用蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)GADD45α及Bcl-x的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Bcl-x的表達(dá)量較之前下降了40%，而GADD45α則下降至陰性對(duì)照組水平。González等[25]選取冠狀動(dòng)脈造影正常的28例原發(fā)性高血壓患者作為試驗(yàn)組，8例尸檢正常的心肌組織作為對(duì)照組，將試驗(yàn)組隨機(jī)分為兩組，分別使用氯沙坦、氨氯地平降壓治療1年，治療前、后使用經(jīng)靜脈心內(nèi)膜心肌活檢技術(shù)取患者心臟室間隔中部心肌組織，采用末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓患者心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較正常心肌組織顯著升高，降壓治療后，氯沙坦治療組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較治療前顯著下降，而氨氯地平治療組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較治療前無明顯變化。由此推斷，GADD45α可能在血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的壓力超負(fù)荷引起的左室心肌肥厚中發(fā)揮重要的作用。

4.2GADD45α與動(dòng)脈粥樣硬化 動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且嚴(yán)重危害人類健康。在長(zhǎng)期的高脂血癥情況下，增高的氧化低密度脂蛋白通過特異性內(nèi)皮細(xì)胞表面的植物血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1介導(dǎo)的內(nèi)皮毒性對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜造成功能性損傷，被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。Thum等[26]用蛋白質(zhì)印跡、半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法發(fā)現(xiàn)植物血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1、GADD45α在主動(dòng)脈粥樣硬化組織中表達(dá)明顯上調(diào)，對(duì)相關(guān)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞受氧化低密度脂蛋白刺激致氧化DNA損傷時(shí)，有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1、GADD45α的表達(dá)顯著增高，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞代謝異常。由此推斷，GADD45α可能在氧化低密度脂蛋白引起的內(nèi)皮損傷中發(fā)揮一定的作用。

Dancu等[27]報(bào)道了血流動(dòng)力學(xué)的改變會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，可能與動(dòng)脈粥樣硬化形成有關(guān)。在人體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化最顯著的地方，如冠狀動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分支外側(cè)壁，流體對(duì)血管壁的剪應(yīng)力相對(duì)較低，流體剪應(yīng)力與固體牽張力最不同步[28]。Lin等[29]將牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞置于不同剪應(yīng)力的層流中剪切，用免疫共沉淀、蛋白質(zhì)印跡、熒光素酶報(bào)告基因法、RNA干擾、基因突變等研究層流剪應(yīng)力影響內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，結(jié)果顯示當(dāng)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在剪應(yīng)力為1.2 N/m2的層流中剪切30 min后便發(fā)現(xiàn)p53磷酸化，24 h后GADD45α及周期蛋白依賴激酶抑制因子p21Cip1的表達(dá)顯著升高，最終細(xì)胞周期依賴性激酶活性及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因磷酸化作用受抑，從而抑制細(xì)胞增殖。使用RNA干擾抑制p53轉(zhuǎn)錄活性、突變WT1位點(diǎn)可以有效抑制層流剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的GADD45α啟動(dòng)子的活性。這些研究表明，在持續(xù)的高層流剪切力作用下，GADD45α以p53依賴的方式表達(dá)上調(diào)，并可能在調(diào)控細(xì)胞周期行進(jìn)、加強(qiáng)DNA修復(fù)及避免細(xì)胞大量增殖及凋亡中發(fā)揮重要的作用。

4.3GADD45α與心臟瓣膜病 心臟瓣膜病是多種原因引起的單個(gè)或多個(gè)瓣膜結(jié)構(gòu)的功能或結(jié)構(gòu)異常。胚胎時(shí)期，心臟瓣膜的發(fā)育異常與心臟瓣膜病密切相關(guān)。堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(basic helix-loop-helix transcription factor 1，TWIST1)在胚胎時(shí)期瓣膜發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[30]。Lee等[31]采用染色體免疫共沉淀、原位雜交、RNA干擾等技術(shù)研究正常小鼠胚胎瓣膜中基因的表達(dá)及作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)GADD45α是TWIST1的靶基因，其內(nèi)含有保守的E-box序列，TWIST1結(jié)合在這一區(qū)域與GADD45α發(fā)揮調(diào)節(jié)心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖與遷移、細(xì)胞外基質(zhì)的合成等作用。

5 結(jié)語與展望

在多種損傷因素刺激下，GADD45α參與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展，并與多種生物大分子相互作用形成一個(gè)關(guān)系緊密而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，例如與Aurora-A、周期蛋白依賴性蛋白激酶2/周期蛋白B1、增殖細(xì)胞核抗原、p21、c-Jun氨基端激酶及GADD45β、GADD45γ相互作用，在維持基因組的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期行進(jìn)、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的功能。闡明GADD45α的功能及其在疾病中的作用機(jī)制，有助于為多種疾病建立更加有效的診斷方法及更安全的治療方案提供思路和途徑。但GADD45α具有多樣的生物學(xué)功能，明確具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1] Liebermann DA,Tront JS,Sha X,etal.GADD45 stress sensors in malignancy and leukemia[J].Crit Rev Oncog,2012,16(1/2):129-140.

[2] Fornace AJ Jr,Nebert DW,Hollander MC,etal.Mammalian genes coordinately regulated by growth arrest signals and DNA-damaging agents[J].Mol Cell Biol,1989,9(10):4196-4203.

[3] Sytnikova YA,Kubarenko AV,Schafer A,etal.Gadd45a is an RNA binding protein and is localized in nuclear speckles[J].PLoS One,2011,6(1):e14500.

[4] Reddy SP,Britto R,Vinnakota K,etal.Novel glioblastoma markers with diagnostic and prognostic value identified through transcriptome analysis[J].Clin Cancer Res,2008,14(10):2978-2987.

[5] Tamura RE,de Vasconcellos JF,Sarkar D,etal.GADD45 proteins:central players in tumorigenesis[J].Curr Mol Med,2012,12(5):634-651.

[6] Daino K,Ichimura S,Nenoi M.Both the basal transcriptional activity of the GADD45A gene and its enhancement after ionizing irradiation are mediated by AP-1 element[J].Biochim Biophys Acta,2006,1759(10):458-469.

[7] Zhan Q,Chen IT,Antinore MJ,etal.Tumor suppressor p53 can participate in transcriptional induction of the GADD45 promoter in the absence of direct DNA binding[J].Mol Cell Biol,1998,18(5):2768-2778.

[8] Fan W,Jin S,Tong T,etal.BRCA1 regulates GADD45 through its interactions with the OCT-1 and CAAT motifs[J].J Biol Chem,2002,277(10):8061-8067.

[9] Lal A,Abdelmohsen K,Pullmann R,etal.Posttranscriptional derepression of GADD45alpha by genotoxic stress[J].Mol Cell,2006,22(1):117-128.

[10] Chang Q,Bhatia D,Zhang Y,etal.Incorporation of an internal ribosome entry site-dependent mechanism in arsenic-induced GADD45 alpha expression[J].Cancer Res,2007,67(13):6146-6154.

[11] Song L,Li J,Zhang D,etal.IKKbeta programs to turn on the GADD45alpha-MKK4-JNK apoptotic cascade specifically via p50 NF-kappaB in arsenite response[J].J Cell Biol,2006,175(4):607-617.

[12] Shao S,Wang Y,Jin S,etal.GADD45α interacts with aurora-A and inhibits its kinase activity[J].J Biol Chem,2006,281(39):28943-28950.

[13] Yang Q,Manicone A,Coursen JD,etal.Identification of a functional domain in a GADD45-mediated G2/M checkpoint[J].J Biol Chem,2000,275(47):36892-36898.

[14] Zhu N,Shao Y,Xu L,etal.GADD45-alpha and GADD45-gamma utilize p38 and JNK signaling pathways to induce cell cycle G2/M arrest in Hep-G2 hepatoma cells[J].Mol Biol Rep,2009,36(8):2075-2085.

[15] Satomi Y.Fucoxanthin induces GADD45A expression and G1arrest with SAPK/JNK activation in LNCap human prostate cancer cells[J].Anticancer Res,2012,32(3):807-813.

[16] Singh R,Cadeddu RP,Frobel J,etal.The non-steroidal anti-inflammatory drugs Sulindac sulfide and Diclofenac induce apoptosis and differentiation in human acute myeloid leukemia cells through an AP-1 dependent pathway[J].Apoptosis,2011,16(9):889-901.

[17] Asuthkar S,Nalla AK,Gondi CS,etal.GADD45α sensitizes medulloblastoma cells to irradiation and suppresses MMP-9-mediated EMT[J].Neuro Oncol,2011,13(10):1059-1073.

[18] Schmitz KM,Schmitt N,Hoffmann-Rohrer U,etal.TAF12 recruits GADD45α and the nucleotide excision repair complex to the promoter of rRNA genes leading to active DNA demethylation[J].Mol Cell,2009,33(3):344-353.

[19] Cortellino S,Xu J,Sannai M,etal.Thymine DNA glycosylase is essential for active DNA demethylation by linked deamination-base excision repair[J].Cell,2011,146(1):67-79.

[20] He YF,Li BZ,Li Z,etal.Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA[J].Science,2011,333(6047):1303-1307.

[21] Edwards MG,Sarkar D,Klopp R,etal.Age-related impairment of the transcriptional responses to oxidative stress in the mouse heart[J].Physiol Genomics,2003,13(2):119-127.

[22] Tran H,Brunet A,Grenier JM,etal.DNA repair pathway stimulated by the forkhead transcription factor FOXO3a through the Gadd45 protein[J].Science,2002,296(5567):530-534.

[23] Sengupta A,Molkentin JD,Paik JH,etal.FOXO transcription factors promote cardiomyocyte survival upon induction of oxidative stress[J].J Biol Chem,2011,286(9):7468-7478.

[24] Rys? J,Aro J,Ruskoaho H.Early left ventricular gene expression profile in response to increase in blood pressure[J].Blood Press,2006,15(6):375-383.

[25] González A,López B,Ravassa S,etal.Stimulation of cardiac apoptosis in essential hypertension:potential role of angiotensin Ⅱ[J].Hypertension,2002,39(1):75-80.

[26] Thum T，Borlak J.LOX-1 receptor blockade abrogates oxLDL-induced oxidative DNA damage and prevents activation of the transcriptional repressor Oct-1 in human coronary arterial endothelium[J].J Biol Chem,2008,283(28):19456-19464.

[27] Dancu MB，Tarbell JM.Large Negative Stress Phase Angle (SPA) attenuates nitric oxide production in bovine aortic endothelial cells[J].J Biomech Eng,2006,128(3):329-334.

[28] Qiu Y，Tarbell JM.Numerical simulation of pulsatile flow in a compliant curved tube model of a coronary artery[J].J Biomech Eng,2000,122(1):77-85.

[29] Lin K,Hsu PP,Chen BP,etal.Molecular mechanism of endothelial growth arrest by laminar shear stress[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(17):9385-9389.

[30] Shelton EL，Yutzey KE.Twist1 function in endocardial cushion cell proliferation,migration,and differentiation during heart valve development[J].Dev Biol,2008,317(1):282-295.

[31] Lee MP，Yutzey KE.Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves[J].PLoS One,2011,6(12):e29758.