蘋果病毒病與無(wú)病毒苗木建園

姜中武 宋來(lái)慶 劉 娟 梁成林 趙建雪 趙玲玲

山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院·265500

蘋果病毒病是危害蘋果樹體生長(zhǎng)的最主要的病害之一，給果農(nóng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，世界上幾乎所有栽培蘋果的國(guó)家和地區(qū)都有病毒的危害。截止目前為止，世界各地已報(bào)告的蘋果病毒已達(dá)有39種之多。根據(jù)病毒對(duì)蘋果的危害特點(diǎn)，通常把蘋果病毒分為潛隱性病毒和非潛隱性病毒兩大類：①潛隱性病毒。這類病毒一般在蘋果的栽培品種上不表現(xiàn)明顯的癥狀。我國(guó)分布最廣的是蘋果褪綠葉斑病毒 (ACLSV)、蘋果莖溝病毒(ASGV)和蘋果莖痘病毒(ASPV)。我國(guó)各蘋果產(chǎn)區(qū)主要栽培品種的潛隱性病毒的帶毒株率在60%～80%。②非潛隱性病毒。這類病毒侵染蘋果樹后，在大多數(shù)品種上都表現(xiàn)明顯的癥狀，根據(jù)其癥狀特點(diǎn)就可進(jìn)行識(shí)別。我國(guó)主要有蘋果花葉病毒、蘋果綠皺果病毒和蘋果銹果類病毒。

1 蘋果病毒病的種類

1.1 蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）

為纖毛病毒科 （Flexiviridae）發(fā)狀病毒屬（Tricho virus）代表種?？汕秩径喾N仁果類和核果類果樹，廣泛分布于世界各個(gè)果產(chǎn)區(qū)。該病毒侵染蘋果樹一般不產(chǎn)生明顯癥狀，但可與其他病毒復(fù)合侵染引起樹體衰退。梨樹感染該病毒后，在某些敏感的植株上產(chǎn)生褪綠斑或環(huán)紋花葉癥狀。該病毒還可引起核果類果樹果實(shí)環(huán)斑或葉片褪綠斑及裂皮等病害癥狀。該病毒侵染蘋果樹后，一般不表明癥狀，僅可影響產(chǎn)量。

1.2 蘋果莖溝病毒（ASGV）

是分布最為廣泛的蘋果病毒，可侵染多種禾本科植物，在果樹上主要通過(guò)嫁接和機(jī)械途徑傳播，關(guān)于該病毒的自然傳播途徑尚不清楚。該病毒侵染蘋果后一般不表現(xiàn)明顯的癥狀，但是可引起樹勢(shì)生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降。2年生梨樹感染該病毒后，干徑生長(zhǎng)速度降低63.0%，莖高降低58.0%，枝梢長(zhǎng)降低51.0%；梨幼苗干莖降低11.7%，苗高降低13.5%。其生長(zhǎng)緩慢主要原因與生長(zhǎng)期幾種促進(jìn)生長(zhǎng)的內(nèi)源激素（IAA、GA3、CTK）大幅下降有關(guān)。

1.3 蘋果莖痘病毒（ASPV）

可侵染多種果樹，分布非常廣泛。ASPV為潛隱性蘋果病毒，在大多數(shù)的蘋果品種上一般不表現(xiàn)癥狀，在一些敏感的砧木（virginia Crab）和栽培品種 （Charden和 Reinette Clochard）上癥狀較明顯，主要表現(xiàn)為葉片反卷、木質(zhì)部莖痘斑、果實(shí)凹陷、葉偏上性生長(zhǎng)。在梨樹上，ASPV能引起梨石痘病(Pear stony pit)、梨脈黃病(Pear vein yellow)等多種病癥。

1.4 蘋果花葉病毒（APMV)

除蘋果和梨外，APMV還有30多種寄主植物，主要為木本植物。APMV侵染蘋果后病樹葉片出現(xiàn)鮮黃色或黃白色斑，或深綠淺綠相間。按變色斑分布樣式，大體有斑駁型、網(wǎng)紋型、花葉型、環(huán)斑型、鑲邊型等幾種類型，各種類型的癥狀可能在同一枝或同一葉片混合出現(xiàn)?？墒垢胁∑贩N的樹體生長(zhǎng)減少50%，樹干直徑減少20%，蘋果產(chǎn)量減少30%。主要通過(guò)嫁接和育苗圃根系嫁接傳播。

1.5 蘋果銹果類病毒（ASSVd）

可侵染多種核果類和仁果類果樹。其發(fā)病癥狀可由于品種和變種不同而不同。ASSVd在一些新品種上的癥狀主要是果面凹陷不平，而在一些老品種上主要花臉。目前在genebank中登記的蘋果ASSVd的變種序列達(dá)48條，煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研究表明，在蘋果上多為復(fù)合侵染，由多條ASSVd變種序列的復(fù)合物所侵染。

1.6 蘋果凹果類病毒（ADFVd）

該類病毒分布范圍比較廣，可侵染多種果樹。該病毒1996年首次在意大利發(fā)現(xiàn)，據(jù)報(bào)道該病毒侵染的蘋果品種主要有紅星、嘎拉、粉紅女士、布瑞本和富士等。其主要發(fā)病癥狀果實(shí)畸形帶有綠色的類似凹坑的斑點(diǎn)。

2 蘋果病毒病脫毒

2.1 熱處理

熱處理脫毒技術(shù)的原理是根據(jù)病毒和寄主植物對(duì)高溫忍耐程度的差異，在一定的溫度下(37～40℃)，病毒被鈍化，失去增殖和再感染能力，而寄主植物正常生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間((3～8周)的處理，枝條前端生長(zhǎng)點(diǎn)附近不含有病毒顆粒，切除這部分進(jìn)行人工培養(yǎng)或嫁接到無(wú)病毒的砧木上得到無(wú)毒的苗木。該技術(shù)的關(guān)鍵問(wèn)題是寄主植物的存活率和脫毒率。處理溫度和高溫持續(xù)時(shí)間、處理方式、寄主植物所帶病毒種類等對(duì)存活率和脫毒率有影響。

2.2 莖尖培養(yǎng)

該技術(shù)脫毒的原理是依據(jù)在植物體內(nèi)病毒濃度呈梯度變化，病毒顆粒隨植物組織的成熟而增加，旺盛生長(zhǎng)的根尖、莖尖很少有病毒分布。莖尖的成活率和脫毒率是莖尖脫毒的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。作為脫毒所用的莖尖，一般以帶有1～2片葉原基，大小為0.1～0.2 mm為宜，超過(guò)0.5 mm時(shí)，脫毒效果差。莖尖大小、細(xì)胞分裂素濃度、繼代次數(shù)影響脫毒率。通過(guò)莖尖培養(yǎng)脫毒一般有以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：①材料處理和接種；②誘導(dǎo)芽分化和小植株的增殖，誘導(dǎo)生根；病毒檢測(cè)；③生根植株的移栽；④移入苗圃。莖尖培養(yǎng)的最大缺點(diǎn)是莖尖不易培養(yǎng)，生根和移栽成活率低。在蘋果和草莓上應(yīng)用二次莖尖脫毒可有效提高脫毒率。

2.3 熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)

熱處理與莖尖培養(yǎng)結(jié)合是現(xiàn)有的效果最好的一種脫毒方法，尤其適用于單獨(dú)熱處理或莖尖培養(yǎng)難以脫除的病毒。該方法首先利用熱處理鈍化病毒，而后利用熱處理過(guò)的嫩梢進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，或?qū)⒃嚬苊邕M(jìn)行熱處理，之后再進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，可提高脫毒率30%～40%，所取莖尖大小因植物種類和待脫病毒種類而異，一般為0.5～2.0 mm。

2.4 莖尖微體嫁接

在莖尖培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，Marashige等提出微體嫁接技術(shù)，即將莖尖分生組織嫁接在試管中經(jīng)脫毒培養(yǎng)的砧木上得到完整的植株。微體嫁接解決了某些木本植物莖尖培養(yǎng)發(fā)根困難、生長(zhǎng)緩慢的問(wèn)題，并且可使復(fù)合侵染的病毒分離。該技術(shù)主要用于核果類果樹的脫毒處理。由于有些病毒通過(guò)種子或花粉傳播，嫁接前應(yīng)對(duì)嫁接砧木進(jìn)行病毒檢測(cè)。微嫁接成活率和脫毒率與莖尖大小、病毒種類和接穗來(lái)源影響有關(guān)。嫁接時(shí)莖尖大小一般為0.2～0.3 mm，即帶2～3個(gè)葉原基，既可除去病毒，又有較高的成活率。

2.5 化學(xué)處理

化學(xué)處理脫毒的作用機(jī)理是利用化學(xué)藥劑抑制植物病毒的復(fù)制來(lái)達(dá)到脫毒的目的?；瘜W(xué)處理往往與組織培養(yǎng)結(jié)合進(jìn)行，即先獲得待脫病毒樣品的莖尖培養(yǎng)植株，然后在進(jìn)行離體植株培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入化學(xué)抑制物質(zhì)，繼代培養(yǎng)一定時(shí)間后，再取新梢在無(wú)化學(xué)抑制劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)病毒檢測(cè)，保留無(wú)病毒的單株。抑制植物病毒活性的化學(xué)物質(zhì)包括代謝拮抗物質(zhì)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等，常用的抗病毒化學(xué)藥物有三氮唑核苷 (病毒唑)，5-二氫尿嘧啶和雙乙酰-二氫-5-氮尿嘧啶。試驗(yàn)證明，12.5 mg/L的抗病毒醚加入培養(yǎng)基80 d (40 d繼代1次)，可脫除ASGV和ACLSV，對(duì)其它病毒則無(wú)效。

2.6 超低溫處理

超低溫處理是新興的植物脫毒技術(shù)，是以超低溫保存和植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的一種方法。該技術(shù)的工作原理是利用液氮超低溫（-196℃）對(duì)植物細(xì)胞的選擇性殺傷，得到存活的頂端分生組織。這是由于頂端分生組織具有具有排列緊密、體積小、立方形、核質(zhì)比高、細(xì)胞質(zhì)濃稠、無(wú)成熟液泡的特點(diǎn)，細(xì)胞自由水含量低，在超低溫環(huán)境中細(xì)胞質(zhì)能保持無(wú)定形狀態(tài)或產(chǎn)生不會(huì)造成細(xì)胞死亡的微小冰粒從而存活。而具有成熟液泡的已分化細(xì)胞，由于含有大量自由水在超低溫環(huán)境中會(huì)形成樹枝狀冰晶，這些冰晶破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。超低溫脫毒技術(shù)包括7個(gè)操作步驟，首先以帶毒的植物為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)建立試管苗體系，而后利用機(jī)械切割的方式獲得植物莖尖，對(duì)莖尖進(jìn)行處理以增強(qiáng)其對(duì)干燥和超低溫的耐受能力，通常是將莖尖培養(yǎng)于含有高濃度蔗糖的培養(yǎng)基上使其脫水，干燥莖尖以增強(qiáng)其對(duì)超低溫的耐受力如無(wú)菌風(fēng)干燥或玻璃化處理，液氮超低溫處理，莖尖復(fù)蘇及再生，再生植株的繼代繁殖及相關(guān)檢測(cè)。該方法采用1.0～1.5 mm的莖尖為試材，降低了試驗(yàn)操作難度，具有操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)周期短、脫毒效率高等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是種間差異大，不同品種需要分別建立脫毒技術(shù)體系，而且超低溫處理后莖尖存活率較低。

3 蘋果病毒病檢測(cè)

蘋果病毒病的檢測(cè)目前所采用的技術(shù)包括指示植物法、血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)和電鏡技術(shù)。

3.1 指示植物法

該方法主要是通過(guò)不同的病毒在不同或相同的寄主植物上產(chǎn)生不同的癥狀來(lái)進(jìn)行的。以對(duì)某種病毒十分敏感的植物作為指示物，將脫毒處理后獲得的植株，嫁接在指示植物上，根據(jù)病毒侵染指示植物后的癥狀，對(duì)病毒的存在與否及種類做出鑒別。常用的病毒指示植物主要有黎科、茄科、豆科、葫蘆科等植物。該方法缺點(diǎn)是特異性較差，靈敏度也較低，往往存在一病多癥、多病一癥的現(xiàn)象。檢測(cè)速度慢，受季節(jié)限制，獲得檢測(cè)結(jié)果所需時(shí)間長(zhǎng)，該方法一般需要 1～2年。

3.2 血清學(xué)檢測(cè)法

目前最常用的血清學(xué)方法是酶聯(lián)免疫吸附法 (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay,ELISA)。ELISA是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)與酶的高效催化反應(yīng)相結(jié)合而應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)的方法。其原理是通過(guò)化學(xué)的方法，將酶與抗體或抗原結(jié)合起來(lái)，形成酶標(biāo)記物，具有活性的酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)，形成更大的復(fù)合體，加入酶反應(yīng)底物呈顏色反應(yīng)，從而達(dá)到檢測(cè)病毒的目的。ELISA法檢測(cè)病毒具有成本低，適于測(cè)定大量樣品，靈敏度較高，可檢測(cè)ng(10-9g)水平的病毒，操作簡(jiǎn)單，不需要使用同位素和復(fù)雜的設(shè)備，且對(duì)人體基本無(wú)害等一系列優(yōu)點(diǎn)。但是，此法檢測(cè)需制備高質(zhì)量的抗血清，免疫反應(yīng)物消耗量較大，抗體(或抗原)被酶聯(lián)板吸附后與抗原(或抗體)的結(jié)合力下降，抗原與抗體結(jié)合比在液相中慢。而且有的病毒在某些情況下缺乏外殼蛋白，如類病毒則沒有外殼蛋白；受病毒系統(tǒng)和復(fù)合侵染的木本植物，鈍化病毒和制備抗血清難于完成；寄主植物中低濃度的病毒無(wú)法檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)有假陽(yáng)性反應(yīng)，需要設(shè)置各種對(duì)照。

3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

分子生物學(xué)方法是通過(guò)檢測(cè)病毒核酸來(lái)證實(shí)病毒的存在，該技術(shù)比ELISA靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速，可用于大量樣品的檢測(cè)，并且適應(yīng)范圍廣，其應(yīng)用的對(duì)象為RNA病毒、DNA病毒及類病毒。目前常用的分子生物學(xué)技術(shù)包括核酸分子雜交技術(shù)、雙鏈RNA電泳技術(shù)、RTPCR技術(shù)。

3.3.1 分子雜交技術(shù) 利用互補(bǔ)的核苷酸序列通過(guò)堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過(guò)程來(lái)進(jìn)行的，檢測(cè)對(duì)象是基因組DNA或總RNA。該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，可檢測(cè)到lpg的植物病毒基因組DNA，但存在同位素標(biāo)記有放射性污染，cDNA探針半衰期短的缺點(diǎn)。

3.3.2 雙鏈RNA電泳技術(shù) 其原理是ssRNA病毒在植物體內(nèi)增殖，通過(guò)核酸互補(bǔ)而形成一種健康植物沒有的堿基配對(duì)dsRNA。dsRNA經(jīng)提純、電泳、染色后，在凝膠上所顯示的譜帶可以反映每種病毒組群的特異性，并且有些單個(gè)病毒的dsRNA在電泳圖譜上也顯示一定的特征。因此，利用病毒dsRNA的電泳圖譜可以檢測(cè)出病毒的類型和種類。已知和未知的病毒及低濃度的病毒，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。但鈍化dsRNA比較麻煩，不能檢測(cè)小于ng級(jí)水平及大規(guī)模樣品。

3.3.3 RT-PCR技術(shù) 是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法，是目前應(yīng)用最為廣泛的果樹病毒檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)克服了上述兩種技術(shù)的缺點(diǎn)，可檢測(cè)fg（10-15g）濃度的植物病毒及大規(guī)模的樣品。近年來(lái)發(fā)展了復(fù)合RT-PCR是在同一RT-PCR反應(yīng)體系中用幾對(duì)不同的引物同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的片段。 應(yīng)用復(fù)合RTPCR和用單一RT-PCR做相同數(shù)目的病毒檢測(cè)相比，節(jié)約了時(shí)間和試劑。PCR技術(shù)用于植物病毒的檢測(cè)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便又無(wú)放射性的危害。近來(lái)，又衍生出一些以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的病毒檢測(cè)方法，如RT-PCR法、IC-PCR法、IC-RT-PCR法、PCR微量板雜交法，套式PCR等。在RT-PCR基礎(chǔ)上又發(fā)展了IC-RT-PCR和多重IC-RT-PCR。與RTPCR相比，IC-RT-PCR技術(shù)可使靈敏度提高1250倍，多重IC-RT-PCR可以準(zhǔn)確的同時(shí)檢測(cè)出兩種以上癥狀相似、難以區(qū)分的病毒。

3.4 電鏡技術(shù)

電子顯微鏡以電磁波為光源，利用短波電子流，分辨率可達(dá)到0.1 nm，而病毒粒體大小為10～100 nm，采用電鏡觀察有無(wú)病毒存在。利用該方法應(yīng)該首先對(duì)不同病毒組的形態(tài)和典型病毒的特點(diǎn)有所了解，將病毒粒體經(jīng)過(guò)提純，用超速離心機(jī)反復(fù)低溫離心，將病毒粒子提純分離出來(lái)。而后用提純液進(jìn)行電鏡制片，觀察病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)。由于電子穿透能力低，樣品必須很薄，制樣需選取病毒濃度最高的組織。

4 已獲的脫毒蘋果品種

由于蘋果病毒病是一種系統(tǒng)性疾病，到目前為止，尚沒有有效的防治方法，培育無(wú)病毒苗木是唯一有效的途徑。我國(guó)蘋果無(wú)病毒蘋果的培育始于上世紀(jì)90年代，經(jīng)過(guò)20多年的研究，利用不同的脫毒方法，目前已獲得30多個(gè)蘋果脫毒品種和砧木。這些品種主要包括煙臺(tái)市農(nóng)科院果樹所培育的煙富3號(hào)、青島農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所董淑英獲得的長(zhǎng)富1、早生喬納金，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)吳玉霞獲得的華紅、紅將軍等12個(gè)品種，粉紅佳人、煙富1號(hào)，以及河北農(nóng)業(yè)大學(xué)晏娜利用化學(xué)處理和熱處理獲得了王林、喬納金、嘎拉、金冠、珠美海棠、天紅1號(hào)、M9等22個(gè)品種（砧木）。

5 脫毒苗木建園

5.1 脫毒苗木園地選擇

脫毒苗木植株長(zhǎng)勢(shì)健壯，和常規(guī)苗木相比，其株行距應(yīng)略大，平原地、土壤肥沃的土地，行距最少為5.0 m，可選用3.0 m×5.0～6.0 m的寬行密植建園模式。建園時(shí)應(yīng)配置適當(dāng)?shù)氖诜蹣洹?/p>

5.2 栽植時(shí)采用行間起壟栽培模式，行間種植黑麥草和鼠茅草或自然生草

秋施基肥一般每667 m2施3000～5000 kg有機(jī)肥，混施100 kg氮、磷、鉀復(fù)合肥；生長(zhǎng)季土壤含水量應(yīng)穩(wěn)定在田間最大持水量的60%～80%；有條件的果園可安裝噴滴灌或水肥一體化設(shè)施，提高肥水利用效率。幼樹期，前期以氮肥為主，后期以磷、鉀肥為主，尤其是在8月份后應(yīng)嚴(yán)格控制氮肥的投入。相同管理?xiàng)l件下，脫毒苗長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)勁，苗木增長(zhǎng)快，后期果園氮肥充裕易出現(xiàn)停長(zhǎng)期而不能及時(shí)停長(zhǎng)的現(xiàn)象，冬季易發(fā)生凍害。

5.3 脫毒蘋果品種長(zhǎng)勢(shì)健壯，對(duì)枝干輪紋病等病害的抗性較強(qiáng)，生產(chǎn)上應(yīng)按照常規(guī)蘋果苗木管理方式做好病蟲害的防治

秋季果樹落葉后，進(jìn)行樹干涂白，防止冬季凍害和幼樹抽條。