腫瘤基因治療的病毒載體研究進(jìn)展

宋向明(綜述)，趙 瑜，田長(zhǎng)富(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，昆明 650500)

腫瘤是目前導(dǎo)致人類(lèi)死亡的第二大疾病。傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療對(duì)于腫瘤晚期的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散未能起到較好的抑制作用，且對(duì)正常細(xì)胞的殺傷力大。近年來(lái)，在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，隨著基因轉(zhuǎn)移的深入研究，基因治療在臨床實(shí)踐，特別是在晚期腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散治療中起到了重要的作用。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制研究的不斷深入，腫瘤基因治療已經(jīng)成為攻克腫瘤最具希望和挑戰(zhàn)的研究領(lǐng)域。目前，應(yīng)用于腫瘤基因治療的載體分為病毒載體和非病毒載體兩大類(lèi)。理想的病毒載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：在特異的組織細(xì)胞中可持續(xù)地、有規(guī)律地表達(dá)外源基因；與細(xì)胞膜親和性高，有一定的靶向性、穩(wěn)定性和安全性。

1 腺病毒載體

腺病毒是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，直徑70～90 nm，基因組長(zhǎng)約36 kb。其有核衣殼，呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)。目前已知的人體腺病毒血清型有51種，基因治療中應(yīng)用最多的為人5型腺病毒[1]。

腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)：可以感染各時(shí)相細(xì)胞；可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)種類(lèi)的細(xì)胞；重組病毒滴度高，易于制備和純化；高效轉(zhuǎn)染，高效表達(dá)；可直接注射于組織原位感染細(xì)胞。腺病毒載體的缺點(diǎn)：高免疫原性；體內(nèi)不能持續(xù)表達(dá)，表達(dá)時(shí)間短；重復(fù)給藥受限制；容量小，可插入外源基因片段的長(zhǎng)度為7～10 kb；靶向性差。

研究表明，腺病毒E1A基因可阻滯正常細(xì)胞抑癌基因的功能，E1B基因可對(duì)抗p53，使病毒能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制[2]。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出缺失E1A和E1B的腺病毒載體，由于其缺少p53和Rb通路，在正常細(xì)胞中可抑制病毒復(fù)制，在腫瘤細(xì)胞中促進(jìn)病毒復(fù)制。5型腺病毒通過(guò)柯薩奇受體感染細(xì)胞，然而，某些腫瘤細(xì)胞，如卵巢癌和胃腸癌細(xì)胞不能表達(dá)柯薩奇受體。此類(lèi)腫瘤可以使用其他血清型腺病毒予以治療，如人35型腺病毒和黑猩猩C1型腺病毒。這些血清型與人5型腺病毒有類(lèi)似的免疫原性[3]。

人體端粒酶在正常組織中不表達(dá)，但在幾乎所有的腫瘤中具有活性[4]。Li等[5]構(gòu)建了由端粒酶啟動(dòng)子啟動(dòng)的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體(TRAIL)基因表達(dá)的腺病毒載體Ad-g TRAIL，檢測(cè)該腺病毒載體在神經(jīng)膠質(zhì)瘤與惡性腦膜瘤中的抗腫瘤活性：與Ad-CMV-GFP相比，Ad-g TRAIL可明顯減小體內(nèi)腫瘤體積以及有效抑制體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

通過(guò)增加病毒載體的靶向性以及與其他抗腫瘤藥物合用，可以改善病毒載體對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)的抑制作用。目前，一種用于改善病毒載體的新方法是使用一種新型的化療藥物——組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可以逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的惡性表型[6]。天然的組蛋白去乙?；敢种苿〧K228是一種二環(huán)的縮酚酸肽，可以抑制組蛋白去乙?；敢种苿瑥亩鴮?dǎo)致去乙酰化組蛋白的積累和誘導(dǎo)細(xì)胞G1與G2/M期阻滯，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的分化和細(xì)胞凋亡。除此之外，F(xiàn)K228可以增強(qiáng)腺病毒的感染效果，部分原因是由于柯薩奇受體表達(dá)上調(diào)。Danielsson等[7]研究表明，在一些腫瘤細(xì)胞中，F(xiàn)K228可以通過(guò)一個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制增加腺病毒的治療效果，并且在藥物預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞中，F(xiàn)K228可以提高腺病毒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。Fujiwara等[8]使用一種有復(fù)制能力的特異性末端轉(zhuǎn)移酶腺病毒Telomelysin[其包含一個(gè)結(jié)合有FK228等抗腫瘤物質(zhì)的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomere reverse transcriptase,hTERT)啟動(dòng)子]治療不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞。hTERT啟動(dòng)子的原理是驅(qū)動(dòng)帶有與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)連接的E1A和E1B基因的表達(dá)，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)可以在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，并且可以對(duì)多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞起到強(qiáng)大的殺傷作用[9]。Fujiwara等[8]發(fā)現(xiàn)，Telomelysin/FK228結(jié)合能夠增強(qiáng)人肺癌細(xì)胞A549中腺病毒的感染和復(fù)制能力，增強(qiáng)人肺癌細(xì)胞H1299中Telomelysin的抗腫瘤作用。

2 腺病毒相關(guān)病毒載體

腺病毒相關(guān)病毒(adenovirus-associated virus,AAV)是非致病性的無(wú)包膜單鏈DNA病毒，直徑20～26 nm，呈20面體結(jié)構(gòu)，是微小病毒家族的成員之一，基因組長(zhǎng)4681 bp，基因組的末端為145 bp的末端反向重復(fù)序列。其末端反向重復(fù)序列之間是AAV編碼區(qū)，左側(cè)的開(kāi)放式閱讀框編碼4種Rep蛋白，為DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白；右側(cè)的開(kāi)放式閱讀框編碼3種核表殼蛋白：VP1、VP2 和VP3，為產(chǎn)生感染性病毒顆粒所必需的外殼蛋白。目前，AAV有13種血清型，不同血清型存在不同的組織親嗜性，如8型AAV對(duì)肝臟和心臟有組織親嗜性，9型AAV對(duì)肺有親嗜性[10]。AAV必須有輔助病毒存在時(shí)才能感染細(xì)胞，一般為腺病毒或皰疹病毒；無(wú)輔助病毒存在時(shí)處于潛伏狀態(tài)，此時(shí)AAV基因組整合到宿主的基因組中(如人基因組第19號(hào)染色體q臂)建立潛伏感染。

AAV載體的優(yōu)點(diǎn)：無(wú)病毒基因表達(dá)；宿主范圍廣，能夠感染非分裂細(xì)胞；低免疫原性；可持續(xù)表達(dá)；安全性好，無(wú)致病性。AAV載體的缺點(diǎn)：可插入外源基因片段的容量低，僅為5 kb；重復(fù)給藥會(huì)產(chǎn)生耐藥性。

Kollipara[11]成功構(gòu)建一種高效安全的AAV載體，其在體內(nèi)和體外均能抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。這種基于AAV載體(AAV2-EzH2-shRNA)的治療是通過(guò)RNA干擾的方法使癌癥促進(jìn)基因EzH2基因沉默。EzH2(Zeste-2的增強(qiáng)子)是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的決定因素，是乳腺癌等腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵組分，通過(guò)允許染色質(zhì)甲基化，導(dǎo)致一些抑癌基因的轉(zhuǎn)錄沉默和腫瘤細(xì)胞分裂[12]。Kollipara[11]研究表明，AAV-EzH2-shRNA轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)達(dá)72 h，可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的抑制率達(dá)到80%；該載體在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中亦能抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)。于磊等[13]成功構(gòu)建了AAV(recombinanted AAV，rAAV)-單純皰疹病毒胸苷激酶(herpeslsimplex virus-thymidine kinase，HSV-TK)基因載體rAAV-TK，該載體可分泌TK基因，在加入更昔洛韋和吉西他濱后，該基因能夠有效誘導(dǎo)膀胱腫瘤細(xì)胞(MB49-PSA)凋亡；轉(zhuǎn)染72 h后，rAAV-TK組細(xì)胞凋亡率為37%，顯著高于空病毒組和空白對(duì)照組。Limberis等[14]研究表明，9型重組腺病毒rAAV9可反復(fù)給藥，可介導(dǎo)目的基因持續(xù)高效地表達(dá)。王峰等[15]利用三質(zhì)粒磷酸鈣共轉(zhuǎn)染的方法成功構(gòu)建9型重組AAV(rAAV2/9)，可介導(dǎo)內(nèi)源性抗腫瘤血管生成因子在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中高效表達(dá)。Kallistatin是絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以有效抑制腫瘤新生血管生成[16]。

3 反轉(zhuǎn)錄病毒載體

反轉(zhuǎn)錄病毒是一種有包膜含反轉(zhuǎn)錄酶的正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)10 kb。該病毒為球形，有核衣殼，呈20面體立體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，病毒核心為兩條相同正鏈單鏈RNA(+ssRNA)，由5′端部分堿基互補(bǔ)成二倍體。其含有序列和功能相似的gag、pol、env三個(gè)結(jié)構(gòu)基因(排列順序?yàn)?′-gag-pol-env-3′)和多個(gè)調(diào)節(jié)基因，Gag編碼病毒的核心蛋白，pol編碼反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，env編碼病毒的外膜蛋白。反轉(zhuǎn)錄病毒通過(guò)env蛋白和細(xì)胞表面受體相互作用侵入宿主細(xì)胞。在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，病毒基因組RNA在反轉(zhuǎn)錄酶的催化下充當(dāng)反轉(zhuǎn)錄模板合成cDNA，在整合酶催化下整合到宿主基因組形成前病毒。前病毒成為宿主基因組的一部分，參與宿主基因組DNA的復(fù)制。宿主轉(zhuǎn)錄器識(shí)別病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列的順式作用元件，并且介導(dǎo)病毒基因表達(dá)。

目前，反轉(zhuǎn)錄病毒載體有兩種類(lèi)型：反轉(zhuǎn)錄病毒載體N2和反轉(zhuǎn)錄病毒載體MFG，兩者在5′端非編碼區(qū)有微小的差別，都包含鼠白血病病毒5′剪接供體位點(diǎn)和病毒基因組RNA衣殼化的完整包裝信號(hào)。此外，MFG載體包含env基因的鼠白血病病毒剪接受體位點(diǎn)，而N2載體不包含此位點(diǎn)。

反轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點(diǎn)：容易制備；外源基因整合入宿主細(xì)胞后可穩(wěn)定表達(dá)；體外分裂細(xì)胞感染率可達(dá)100%，轉(zhuǎn)染效率高；低免疫原性。反轉(zhuǎn)錄病毒載體的缺點(diǎn)：只能感染分裂細(xì)胞；隨機(jī)整合入宿主基因組，有潛在危險(xiǎn)性；容量小，可插入外源基因片段的長(zhǎng)度為8 kb；病毒滴度低，為106～107pfu/mL。

田晨等[17]成功構(gòu)建小鼠Hes1基因過(guò)表達(dá)反轉(zhuǎn)錄病毒載體MSCV-Hes1-IRES-GFP。該實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)Hes1基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后第3日轉(zhuǎn)染率約為95%，Hes1基因表達(dá)量約為對(duì)照組的5倍；病毒上清感染Lin-細(xì)胞后第5日感染率約為7%，Hes1基因的表達(dá)量約為對(duì)照組的6倍。因小鼠Lin-造血細(xì)胞一般處于非分裂期，而反轉(zhuǎn)錄病毒感染分裂細(xì)胞，故在感染前加入細(xì)胞因子、干細(xì)胞因子、血小板生成素、 FMS樣的酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase-3，F(xiàn)lt3)配體，可使Lin-造血細(xì)胞處于分裂期，雖然感染率仍不理想(7%)，亦可進(jìn)一步做深入功能研究。

4 HSV載體

HSV為雙鏈DNA病毒，根據(jù)其抗原性的不同可分為Ⅰ型和Ⅱ型。HSV基因組約為152 kb，含有34個(gè)基因，可編碼70余個(gè)多肽。HSV能夠復(fù)制和感染多數(shù)的上皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞[18]。

HSV的優(yōu)點(diǎn)：容量大，可插入外源基因的片段為25 kb；宿主范圍廣；可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞；具有嗜神經(jīng)性，可在感覺(jué)神經(jīng)元潛伏感染，可應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病。HSV的缺點(diǎn)：高免疫原性；體內(nèi)不能持續(xù)表達(dá)目的基因。

Jones[19]和Halford等[20]利用溶瘤性皰疹病毒載體，使致病基因ICP4和γ34.5發(fā)生突變。在惡性膠質(zhì)瘤、膀胱癌和乳腺癌轉(zhuǎn)移的人體模型中，缺少γ34.5和UL39基因功能的HSV載體用瘤內(nèi)注射的方法可以使腫瘤細(xì)胞凋亡。在胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌中，黏蛋白基因過(guò)度表達(dá)[21]。在人肝癌中，突變的HSV載體在MUC1啟動(dòng)子的控制下表達(dá)γ34.5可導(dǎo)致復(fù)制受限。此外，臨床試驗(yàn)表明，成人對(duì)于HSV良好的耐受性導(dǎo)致腫瘤的穩(wěn)定和消退[22-24]。利用血漿除去法聯(lián)合溶瘤細(xì)胞治療法去除人體內(nèi)的HSV抗體，會(huì)降低靜脈注射和瘤內(nèi)注射HSV的療效。蔡曉輝等[25]成功構(gòu)建能夠表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因的重組HSV-1載體，細(xì)胞半數(shù)感染量法測(cè)得病毒滴度為2.25×106IU/mL。呂芳彪等[26]通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)成功擴(kuò)增了HSV-Ⅱ型潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體開(kāi)放讀碼框1基因，然后將其連接到帶有GFP基因標(biāo)記的pEGFP-C2 載體上，構(gòu)建了pEGFP-開(kāi)放讀碼框1真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測(cè)到開(kāi)放讀碼框1基因在細(xì)胞中表達(dá)，用熒光顯微鏡觀察到熒光蛋白的表達(dá)。

5 其他病毒載體

2011年發(fā)明的一項(xiàng)專(zhuān)利“利用經(jīng)改造的呼吸道合胞體病毒治療乳腺癌”，研究者用改造的一種溶瘤細(xì)胞呼吸道合胞體病毒治療乳腺癌。該病毒缺少NS 1基因(NS 1蛋白為Ⅰ型干擾素的拮抗劑)，研究發(fā)現(xiàn)該病毒能夠使乳腺癌細(xì)胞凋亡而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響，其機(jī)制為增加Ⅰ型干擾素，Ⅰ型干擾素能夠在體外和體內(nèi)(BALB/c裸鼠體內(nèi)皮下種植MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞)實(shí)驗(yàn)中阻止病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制，同時(shí)誘導(dǎo)其在MDA-MB-23乳腺癌細(xì)胞中的抑瘤作用[27]。痘病毒為線型雙鏈DNA病毒，有包膜，不與宿主基因組整合。其主要的缺點(diǎn)是免疫原性高。該載體用于腫瘤基因治療研究，Hu等[28]構(gòu)建攜帶TK基因的類(lèi)牙巴病病毒載體，并加入GFP熒光蛋白基因，在卵巢癌小鼠模型中，腹腔注射該病毒12 d后，在腫瘤組織中有38%的細(xì)胞表達(dá)GFP蛋白。目前，痘病毒多應(yīng)用于疫苗的研制與開(kāi)發(fā)，包括艾滋病疫苗和禽流感疫苗，基于痘病毒載體研制的反轉(zhuǎn)錄病毒144艾滋病疫苗已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。

此外，還有重組仙臺(tái)病毒、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒、牛乳頭狀瘤病毒載體等也有相關(guān)報(bào)道。

6 展 望

腫瘤的發(fā)生在本質(zhì)上由基因決定，遺傳因素和環(huán)境因素以協(xié)同或序貫的方式引起DNA損害，從而滅活抑癌基因和激活原癌基因，凋亡調(diào)節(jié)基因和改變DNA修復(fù)基因引起表達(dá)水平的異常，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此，腫瘤基因治療的發(fā)展前景廣闊，腫瘤基因治療載體也成為腫瘤基因治療至關(guān)重要的組成部分。目前，腫瘤基因治療的載體較多，有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在能夠高效持續(xù)表達(dá)外源基因的同時(shí)，如何能夠降低免疫原性，提高安全性，以及如何利用外源基因來(lái)彌補(bǔ)病毒載體的部分缺陷是未來(lái)的研究方向。

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