上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在食管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的研究進(jìn)展

王國(guó)田，張洋洋，王志敏(綜述),李前文,杜云翔※(審校)

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生部,安徽 蚌埠 233000; 2.南京軍區(qū)第八二醫(yī)院腫瘤中心,江蘇 淮安 223001)

腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤生物學(xué)特征之一，是導(dǎo)致治療方案失敗、預(yù)后不良、乃至患者死亡的重要因素,有關(guān)惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程,有利于腫瘤轉(zhuǎn)移。我國(guó)是食管癌的高發(fā)區(qū)之一，其病死率在惡性腫瘤死因順位中高居第4位，占惡性腫瘤死亡數(shù)的11.19%[1]。食管癌起病隱匿，大部分患者就診時(shí)多已發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此為改善食管癌的治療效果，對(duì)于EMT與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究逐漸成為腫瘤研究的焦點(diǎn)。

1 EMT相關(guān)蛋白與食管癌

1.1上皮鈣黏素 上皮鈣黏素是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為120×103依賴Ca2+的細(xì)胞間跨膜糖蛋白，上皮鈣黏素與連環(huán)素蛋白(α、β和γ)結(jié)合，再連接到細(xì)胞骨架上，以維持細(xì)胞間的穩(wěn)定性和細(xì)胞的黏附極性。在食管癌中能觀察到上皮鈣黏素減少時(shí)腫瘤侵襲能力增加[2]，腫瘤轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[3]。鈣黏素表達(dá)水平顯著低于癌旁組織和正常食管組織，并且在不同浸潤(rùn)深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及腫瘤分化程度不同的食管癌組織鈣黏素蛋白表達(dá)具有明顯差異。在OE33食管腺癌細(xì)胞株中，上皮鈣黏素表達(dá)沉默與食管腺癌進(jìn)展密切相關(guān)[4]。

1.2波形蛋白 在EMT發(fā)生過程中，除了有上皮鈣黏素表達(dá)缺失，還伴有其他蛋白的生成。如在EMT發(fā)生后，波形蛋白表達(dá)增加，波形蛋白與上皮鈣黏素表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[5-6]，波形蛋白是正常細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)細(xì)胞之間的中間纖維的主要蛋白成分，經(jīng)常用來作為間充質(zhì)病變的鑒別診斷，現(xiàn)在認(rèn)為波形蛋白是EMT的標(biāo)志物。波形蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞表現(xiàn)梭形、多角形的形態(tài)，波形蛋白表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，包括遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)[7]。

1.3神經(jīng)鈣黏素 神經(jīng)鈣黏素是鈣黏素家族成員之一，相對(duì)分子質(zhì)量為127×103，早期的研究表明，神經(jīng)鈣黏素在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用，現(xiàn)在越來越多的研究證實(shí)，神經(jīng)鈣黏素的高表達(dá)與惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-9]。食管鱗癌組織中神經(jīng)鈣黏素的高表達(dá)與食管鱗癌的浸潤(rùn)、惡化有密切的關(guān)系。RNA干擾(RNA interference,RNAi)沉默神經(jīng)鈣黏素基因表達(dá)能夠使EC9706體外侵襲能力降低[10]。激活素A是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族成員之一，在胚胎干細(xì)胞分化方面發(fā)揮了重大作用。激活素A誘導(dǎo)神經(jīng)鈣黏素的表達(dá)與腫瘤侵襲和預(yù)后差有關(guān)[9]。

2 EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與食管癌

2.1Twist轉(zhuǎn)錄因子 Twist是一個(gè)保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，已被明確作為上皮鈣黏素的抑制因子，能誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。人類Twist基因位于染色體7q21.2處，含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。人Twist蛋白分子包含202個(gè)氨基酸，由N端、堿性螺旋-環(huán)-螺旋、C端三個(gè)區(qū)域組成[11]。Twist作用于上皮鈣黏素上游合成過程，能識(shí)別上皮鈣黏素啟動(dòng)子上的E-box序列，抑制上皮鈣黏素的轉(zhuǎn)錄表達(dá)促進(jìn)EMT，使腫瘤細(xì)胞容易脫離原發(fā)灶向周圍組織侵襲，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而抑制細(xì)胞的凋亡。Twist可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的合成，從而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生。這些特性決定著Twist基因與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。轉(zhuǎn)錄因子Twist在食管鱗癌高表達(dá)，并且與預(yù)后差、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和5年生存率低密切相關(guān)[12-14]。高表達(dá)的Twist腫瘤組織有更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、更高的分期和淋巴結(jié)浸潤(rùn)，且Twist高表達(dá)和上皮鈣黏素減少有重要聯(lián)系，兩者呈負(fù)相關(guān)。Twist高表達(dá)和上皮鈣黏素缺失時(shí)，患者生存率也會(huì)降低。因此，Twist也可以作為判斷預(yù)后效果的標(biāo)記和分子靶標(biāo)。

2.2snail轉(zhuǎn)錄因子家族 snail轉(zhuǎn)錄因子家族包括snail(snail1)、slug(snail2)和無明顯特征的Smuc(snail3)，人類snail基因位于染色體20q13.13處。所有這些snail家族成員在結(jié)構(gòu)上具有相似性，包括含有4～6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的高度保守的C端和一個(gè)高度可變的N端。Snail可與靶基因上含有的CAG-GTG核心堿基序列的E-box作用元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)其表達(dá)[15]。snail最初在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育中起重要作用，以后的研究也發(fā)現(xiàn)，snail和slug同Smad相互作用蛋白1(Smad-interacting protein-1，SIP-1)可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合E-box序列，抑制上皮鈣黏素的表達(dá)和波形蛋白表達(dá)水平的上升。Snail通過直接抑制鈣黏素表達(dá)而誘導(dǎo)EMT，snail高表達(dá)更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血道轉(zhuǎn)移，與腫瘤分期密切相關(guān)[16-17]。slug是一個(gè)新的被認(rèn)為是抑制上皮鈣黏素表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，上皮鈣黏素表達(dá)與slug呈負(fù)相關(guān)，上皮鈣黏素表達(dá)減少或slug表達(dá)陽性更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)更深，預(yù)后更差[18]，提示slug是一個(gè)與轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的因子。Uchikido等[18]報(bào)道，slug在食管鱗癌高表達(dá)且與腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。slug在腺癌高表達(dá)，與上皮鈣黏素低表達(dá)顯著相關(guān)，在OE33細(xì)胞中slug過表達(dá)，抑制了上皮鈣黏素的表達(dá)，誘導(dǎo)了間質(zhì)型標(biāo)志物波形蛋白和纖維連接蛋白的表達(dá)[4]，提示slug在食管癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。

2.3ZEB家族轉(zhuǎn)錄因子 鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子中的E盒結(jié)合鋅指蛋白(zinc finger E-box-binding protein，ZEB)是胚胎發(fā)育中的重要的轉(zhuǎn)錄因子。ZEB家族轉(zhuǎn)錄因子屬于鋅指蛋白類，包括ZEB1(δEF1)和ZEB2(SIP1)，ZEB1(δEF1)和ZEB2(SIP1)直接結(jié)合于受調(diào)節(jié)區(qū)域中的5′-CACCT序列，抑制鈣黏素的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT。ZEB家族能促進(jìn)EMT的發(fā)生，它是鈣黏素的主要調(diào)節(jié)因子，在EMT發(fā)生過程中能夠下調(diào)鈣黏素的表達(dá)。最近研究表明，ZEB家族受微RNA的調(diào)節(jié)，ZEB家族水平與微RNA-200家族成員水平呈負(fù)相關(guān)，Notch蛋白的表達(dá)上調(diào)ZEB家族，下調(diào)微RNA-200，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞向特定方向分化，Notch3是抑制ZEB家族表達(dá)的關(guān)鍵因素[19]。微RNA-205也可以調(diào)節(jié)ZEB1和ZEB2，抑制上皮鈣黏素的表達(dá)，而促進(jìn)EMT的發(fā)生[20]。

3 EMT相關(guān)微RNA與食管癌

微RNA是一類內(nèi)源性、高保守、大小為20～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)功能。一些微RNA位于腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)，而且微RNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平與正常組織有明顯的差異，所以說，微RNA可能參與了腫瘤形成中生理和病理過程[21]。微RNA也參與對(duì)EMT的調(diào)控，在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。利用微RNA靶基因預(yù)測(cè)算法(靶基因預(yù)測(cè)軟件)，ZEB家族被預(yù)測(cè)包括微RNA-200家族大量結(jié)合位點(diǎn)，而且兩個(gè)微RNA-205結(jié)合位點(diǎn)已明確。微RNA-205通過調(diào)節(jié)ZEB2的表達(dá)而誘導(dǎo)EMT。食管細(xì)胞株微RNA-205表達(dá)水平較其他惡性腫瘤細(xì)胞株及正常食管上皮細(xì)胞明顯增高，微RNA-205可以促使食管癌發(fā)生EMT，可能參與食管癌浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制[22]。

4 EMT相關(guān)生長(zhǎng)因子與食管癌

EMT的發(fā)生是由腫瘤細(xì)胞之間以及腫瘤細(xì)胞與其細(xì)胞間質(zhì)之間的復(fù)雜的相互作用誘導(dǎo)的，包括基質(zhì)和細(xì)胞外成分，如通過自分泌和旁分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。EMT相關(guān)生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)、TGF-β家族、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors,FGFs)、胰島素樣生長(zhǎng)因子家族等。

4.1TGF-β 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族包括激活素、抑制素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、苗勒管抑制物等。TGF-β主要包括三個(gè)亞型：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1是一種在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡具有雙重作用的細(xì)胞因子。TGF-β有三種高親和性受體：TGF-Ⅰ、TGF-Ⅱ和TGF-Ⅲ。TGF-Ⅲ隨TGF-β結(jié)合到兩種單跨膜絲氨酸/蘇氨酸受體，主要為Ⅰ型[人活化素受體樣激酶1(activin receptor-like kinase-1,ALK1),ALK2,ALK5]和Ⅱ型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體，形成包括兩個(gè)Ⅰ型和Ⅱ型受體的異四聚體?；罨蘑裥褪荏w可以磷酸化其下游信號(hào)分子Smad-2與Smad-3，進(jìn)而與Smad-4形成三聚體復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核，與smad結(jié)合元件結(jié)合后誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。參與TGF-β的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，除了smad依賴通路，還有非smad依賴通路，如磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路、絲裂原活化蛋白激酶通路、Rho-GTP酶通路等[23]。TGF-β具有雙重作用，既能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，又能誘導(dǎo)EMT促使腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

在食管癌中，TGF-β被認(rèn)為是誘導(dǎo)EMT的重要因子，是目前研究最廣泛的EMT誘導(dǎo)因子。TGF-β1誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞株EC9706發(fā)生EMT，將化學(xué)合成的TGF-β1的反義寡核苷酸(TGF-β1-Antisens Oligo Deoxy Nucleotides,TGF-β1-ASODN)轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株EC9706，TGF-β1可導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌上皮性標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)性標(biāo)志物波形蛋白表達(dá)下調(diào)，形態(tài)發(fā)生改變以及細(xì)胞的移動(dòng)能力降低，沉默TGF-β1可抑制食管鱗癌細(xì)胞株的EMT[24-25]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表證明，TGF-β誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞，其上皮標(biāo)志物上皮鈣黏素、緊密連接蛋白1、橋粒蛋白Ⅰ/Ⅱ表達(dá)下降，同時(shí)間質(zhì)標(biāo)記纖維連接蛋白表達(dá)下降[26]。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)100例食管鱗癌手術(shù)切除標(biāo)本中的TGF-β1、鈣黏素、波形蛋白的表達(dá)，TGF-β1蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)顯著高于正常黏膜，其在深層浸潤(rùn)組織中的表達(dá)高于淺層浸潤(rùn)組織[27]。

有研究表明，胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3能促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT，也促進(jìn)了Smad2和Smad3的磷酸化[28]。但是，TGF-β誘導(dǎo)的EMT也能被骨形成蛋白7和Smad4 RNAi逆轉(zhuǎn)[29]。轉(zhuǎn)染TGF-β1-ASODN可特異性地抑制食管鱗癌細(xì)胞EC9706中TGF-β1表達(dá)。

4.2EGF EGF通過與表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合誘導(dǎo)EMT。表皮生長(zhǎng)因子受體在食管癌中表達(dá)，能促進(jìn)EMT亞群細(xì)胞富集，并且與預(yù)后不良、化療抵抗等密切相關(guān)[30]。在EC109細(xì)胞中，maspin蛋白(一種抑制腫瘤的絲氨酸蛋白酶抑制劑，它在抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定作用)抑制EGF誘導(dǎo)的EMT，改變了細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。一些具有選擇性EGF的酪氨酸酶抑制劑(如厄洛替尼、人類單克隆抗體西妥昔單抗等)已在臨床治療中顯示出良好的療效[31]。EGF誘導(dǎo)的EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用。有研究表明，EGF通過激活Janus蛋白酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(Janus protein tyrosine kinse/signal transducers and activators of transcription 3,JAK/STAT3)信號(hào)通路而誘導(dǎo)EMT[31]。STAT蛋白是轉(zhuǎn)錄因子家族成員，這些多功能蛋白磷酸化激活后，可調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，STAT3基因是該家族現(xiàn)已被公認(rèn)的癌基因，持續(xù)活化的STAT3可調(diào)控下游多個(gè)與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。信號(hào)蛋白STAT3可能參與了食管鱗癌的EMT過程，并與食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。

4.3HGF HGF是間質(zhì)型細(xì)胞的活性因子，可促進(jìn)有絲分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等，HGF是一個(gè)已知的能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和侵襲的血管生長(zhǎng)因子。HGF及其受體c-Met在腫瘤侵襲和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清中HGF的水平明顯高于對(duì)照組健康人，提示HGF的水平可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，HGF在血清中的表達(dá)水平可以作為評(píng)價(jià)預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)[32]。HGF能夠刺激食管鱗狀細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和白細(xì)胞介素8，從而增加細(xì)胞的侵襲和遷移能力[32]。

4.4FGFs 目前已發(fā)現(xiàn)有9種FGFs，分別為酸性FGF(FGF-1)，堿性FGF(FGF-2)，Int-2(FGF-3),FGF-4，F(xiàn)GF-5，F(xiàn)GF-6，角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-7)，雄激素誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子(FGF-8)和神經(jīng)膠質(zhì)激活因子(FGF-9)。FGFs是促進(jìn)生長(zhǎng)、抗凋亡、能夠編碼肝素結(jié)合蛋白相關(guān)基因家族成員之一，能夠以自分泌和旁分泌的方式導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。目前有研究發(fā)現(xiàn)，食管癌中b-FGF的陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(食管炎組織),并且b-FGF的表達(dá)與食管癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期顯著相關(guān)[33]。提示b-FGF可能在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，作為食管癌治療中的一個(gè)新靶點(diǎn)對(duì)治療及預(yù)后有較好理論價(jià)值。

4.5胰島素樣生長(zhǎng)因子家族 胰島素樣生長(zhǎng)因子1是胰島素樣生長(zhǎng)因子家族的成員,是由70個(gè)氨基酸組成的多肽。絕大部分的胰島素樣生長(zhǎng)因子1與特異性胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3以結(jié)合形式存在。胰島素樣生長(zhǎng)因子1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂增殖,促進(jìn)細(xì)胞向惡性表型轉(zhuǎn)化,并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有研究報(bào)道，食管癌患者血清中胰島素樣生長(zhǎng)因子1的水平明顯高于健康人，提示胰島素樣生長(zhǎng)因子1的水平可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[34]。胰島素樣生長(zhǎng)因子1可刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制凋亡，胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3則抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子1的生物活性[34]。另有研究表明，胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3能促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT發(fā)生，也促進(jìn)了Smad2和Smad3的磷酸化[28]。

5 結(jié) 語

腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤預(yù)后不良和導(dǎo)致死亡的主要原因，EMT是腫瘤侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的重要事件，在食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，與患者的預(yù)后密切相關(guān)。目前對(duì)于EMT與食管癌的研究正不斷深入，其在食管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用不斷被發(fā)現(xiàn)，探討EMT的發(fā)生機(jī)制及相關(guān)性可以為以后食管癌臨床治療提供新的路徑和靶點(diǎn)。

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