脫落細(xì)胞學(xué)的細(xì)胞塊制作及應(yīng)用的研究進(jìn)展

林 靜(綜述)，周英瓊(審校)

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西 桂林 541001)

常用脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本包括痰液、尿液、漿膜腔積液(胸腔、腹腔、心包腔積液)、灌洗液、穿刺標(biāo)本等。由于取材方便、經(jīng)濟(jì)、快速、無創(chuàng)或微創(chuàng)使脫落細(xì)胞學(xué)檢查成為臨床進(jìn)行疾病篩查、診斷和研究的一種重要手段。目前在基層單位，大部分細(xì)胞學(xué)檢查停留在將送檢樣本涂片直接染色觀察這一較為傳統(tǒng)的模式上,而傳統(tǒng)涂片方式由于涂片厚、細(xì)胞重疊、結(jié)構(gòu)不清、細(xì)胞量少，使細(xì)胞學(xué)的陽性檢出率和敏感性均不高。細(xì)胞塊技術(shù)是基于細(xì)胞學(xué)的組織塊技術(shù)，能夠增加細(xì)胞學(xué)檢出的陽性率并提高準(zhǔn)確性，適于在基層醫(yī)院推廣。

1 傳統(tǒng)脫落細(xì)胞學(xué)制備方法及局限性

傳統(tǒng)脫落細(xì)胞學(xué)通常采用離心5 min(2000 r/min)后直接涂片、蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色或瑞氏染色觀察結(jié)果。由于傳統(tǒng)涂片收集的細(xì)胞有時(shí)較少、組織形態(tài)不典型等使細(xì)胞學(xué)檢查易存在假陰性，涂片厚薄不均而導(dǎo)致陽性物質(zhì)定位不清出現(xiàn)假陽性[1-2]。另外，在診斷上還有組織分型困難、腫瘤部位難確定、不能連續(xù)切片和永久保存標(biāo)本等局限性，一定程度上制約了細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用及發(fā)展。

以漿膜腔積液為例，由于傳統(tǒng)涂片法存在涂片厚、細(xì)胞重疊、結(jié)構(gòu)不清、細(xì)胞量少、陽性檢出率低等缺點(diǎn)，診斷的靈敏度僅為50%～78%[3]，特別是對(duì)細(xì)胞形態(tài)不典型的間皮細(xì)胞、轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的鑒別僅用直接離心涂片法常難以鑒別。文獻(xiàn)報(bào)道，有高達(dá)12%的病例會(huì)遇到間皮細(xì)胞與癌細(xì)胞難以鑒別的狀況[4]。這種診斷的不明確甚至可以延誤治療。

2 細(xì)胞塊技術(shù)的原理與方法

細(xì)胞塊技術(shù)的基本原理是將樣品離心，細(xì)胞和微小組織塊被高度濃縮后固定，石蠟包埋后切片染色觀察[5]。細(xì)胞塊石蠟包埋切片收集到的有核細(xì)胞多、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,與常規(guī)涂片法相結(jié)合,可以大大提高細(xì)胞學(xué)的陽性檢出率，對(duì)細(xì)胞量較少、診斷困難的標(biāo)本意義更大。而且細(xì)胞塊通過石蠟包埋后類似組織塊，可以連續(xù)切片及永久性保存標(biāo)本，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)涂片的不足，更可以進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)檢測(cè)。

關(guān)于細(xì)胞塊技術(shù)的應(yīng)用在文獻(xiàn)中可見零星報(bào)道，制備方式也各異，常用的有普通離心沉淀法和瓊脂凝聚法[6]，另有姚宇琪等[7]報(bào)道的試管包埋法及王永生等[5]報(bào)道的蛋清凝聚法，這幾種方法主要在保存細(xì)胞及固定支架上存在差異。關(guān)于細(xì)胞塊制備技術(shù)的關(guān)鍵是要盡量完整保存標(biāo)本，在制備時(shí)盡量減少細(xì)胞收縮、能夠較好地脫水、透明、浸蠟。

2.1普通離心沉淀法 將樣本放在試管中離心后，去上清，用鑷子盡可能將底部的沉淀物取出，用拭鏡紙包好放入包埋盒中，置入10%中性甲醛溶液中固定2 h后常規(guī)脫水包埋。這種方法簡(jiǎn)單易行，但是在收集沉淀物時(shí)會(huì)存在收集不全的情況。此外，對(duì)于一些細(xì)胞量少的標(biāo)本無法制作成細(xì)胞塊。由于沉淀物中沒有固定支架，可能存在切片后脫片，染色困難的情況。

2.2試管包埋法 其是姚宇琪等[7]對(duì)普通離心沉淀法進(jìn)行改良后發(fā)展出來的一種細(xì)胞塊制作技術(shù)。主要技術(shù)要點(diǎn)為將樣本在一次性塑料試管中離心后，去上清，用手術(shù)剪在距試管底部沉淀物上方0.1～0.2 cm處剪去上段試管,將裝有沉淀物的試管底端置入包埋盒中，在10%中性甲醛溶液中固定2 h后常規(guī)脫水包埋。這種方法簡(jiǎn)單且收集的細(xì)胞信息全面，不存在細(xì)胞成分丟失的情況，但同樣由于沉淀物中沒有固定支架，可能存在切片后脫片，染色困難的情況。

2.3瓊脂凝聚法 這是細(xì)胞塊制作常用的一種方法[8]。技術(shù)要點(diǎn)為將樣本放在試管中離心后，去上清，在其中加入融化的瓊脂混勻后再次離心，取沉淀物用拭鏡紙包好后放置入包埋盒中，在10%中性甲醛溶液中固定2 h后常規(guī)脫水包埋。這種方法細(xì)胞丟失較少，但是瓊脂臨用前需要水浴加熱溶解后方可使用，且瓊脂不溶于乙醇、二甲苯，凝固后密度大、組織內(nèi)外液體不易滲透、切片、染色效果欠佳。

2.4蛋清凝聚法 王永生等[5]報(bào)道，將樣本放在試管中離心后，去上清，在其中加入市售雞蛋清液或鵪鶉蛋清液混勻后再次稍離心，取沉淀物用拭鏡紙包好后置入包埋盒中，在10%中性甲醛溶液中固定2 h后常規(guī)脫水包埋。這種方法細(xì)胞丟失較少，雞蛋清作為一種高效價(jià)蛋白質(zhì),具有較強(qiáng)的滲透性,蛋清遇乙醇后可以凝固成塊狀(即蛋白支架),細(xì)胞被網(wǎng)絡(luò)其中,不易丟失,有利于取材和包埋。

2.5凝血酶血清凝聚法 將樣本放在試管中離心后，在其中加入凝血酶及人血清混勻后再次稍離心，取沉淀物用拭鏡紙包好后置入包埋盒中，在10%中性甲醛溶液中固定2 h后常規(guī)脫水包埋。這種方法細(xì)胞丟失較少，人血清遇乙醇后可以凝固成塊狀,細(xì)胞被網(wǎng)羅其中,不易丟失,有利于取材和包埋，且試劑來源方便。但是細(xì)胞成分依然會(huì)有一定丟失[9]。

3 細(xì)胞塊在脫落細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用

細(xì)胞塊制成后可以連續(xù)切片，根據(jù)診斷及研究需要開展類似組織學(xué)的各種檢查[10]。

3.1HE染色 脫落細(xì)胞的性質(zhì)有良惡性之分，通過傳統(tǒng)涂片有時(shí)是難以診斷的。在制成細(xì)胞塊后，其中往往有一些小的組織團(tuán)塊，在HE染色中可以清晰地展現(xiàn)出其來源組織的結(jié)構(gòu)。如腺癌可以觀察到腺體或乳頭狀結(jié)構(gòu)。其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)與組織學(xué)非常相似，對(duì)于診斷有極大幫助。

3.2免疫細(xì)胞化學(xué) 惡性腫瘤在組織形態(tài)上時(shí)常無法區(qū)分其來源和發(fā)生部位，尤其對(duì)于體質(zhì)較差的患者進(jìn)行手術(shù)局部取材往往具有較大的風(fēng)險(xiǎn)，患者也會(huì)承受較大的痛苦，造成患者治療上的困難。用細(xì)胞塊進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色可連續(xù)切片,有利于多種抗體組合運(yùn)用觀察,陽性顆粒為棕黃色,定位準(zhǔn)確可靠、背景清晰、可重復(fù)性高,提高了疑難病例診斷的準(zhǔn)確率[11]，對(duì)于尋找轉(zhuǎn)移腫瘤原發(fā)病灶其功效類似于免疫組織化學(xué)法。陳穎等[12]研究認(rèn)為，D2-40、Calretinin等在惡性腹水中高表達(dá)；陳歷國(guó)等[13]和Stopyra等[14]研究認(rèn)為，細(xì)胞角蛋白7、細(xì)胞角蛋白20鑒別轉(zhuǎn)移性腸癌引起的腹水具有高特異性及敏感性；智俐等[15]通過30例切片陽性的細(xì)胞塊標(biāo)記抗體癌胚抗原、Calretinin檢測(cè)，認(rèn)為將漿膜腔積液脫落細(xì)胞制備瓊脂細(xì)胞塊,選擇特異性抗體標(biāo)記,對(duì)診斷及鑒別診斷有重要意義。但是，由于細(xì)胞塊本身是分散細(xì)胞的集合，對(duì)某一特定細(xì)胞的比較有時(shí)會(huì)較為困難。

3.3熒光原位雜交 該技術(shù)是利用已知核酸序列作為探針，以熒光素直接標(biāo)記或先以非放射性物質(zhì)標(biāo)記后與靶 DNA進(jìn)行雜交，再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光素標(biāo)志物，最后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號(hào)，從而對(duì)標(biāo)本中待測(cè)核酸進(jìn)行定性、定位和定量分析的方法[16]。乳腺癌組織中有無人表皮生產(chǎn)因子受體2基因擴(kuò)增和蛋白過度表達(dá),對(duì)于判斷患者的預(yù)后、預(yù)測(cè)臨床療效以及選擇使用赫賽汀生物靶向治療有重要意義,因此準(zhǔn)確檢測(cè)人表皮生產(chǎn)因子受體2基因和蛋白狀況極為關(guān)鍵[17-18]。最近有研究表明[16，19],淋巴瘤患者存在基因和染色體變異,這些變異在淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后評(píng)價(jià)等方面均有要意義。對(duì)于手術(shù)取材困難、一般情況差的患者，通過細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)采集的標(biāo)本可以制作成細(xì)胞塊來進(jìn)行熒光原位雜交檢測(cè)，從對(duì)腫瘤的影響及治療進(jìn)行綜合判斷。

4 展 望

傳統(tǒng)涂片收集的細(xì)胞少而易出現(xiàn)假陰性，涂片厚薄不均而致陽性物質(zhì)定位不清出現(xiàn)假陽性，更不能連續(xù)切片及永久性保留標(biāo)本。細(xì)胞塊技術(shù)可彌補(bǔ)上述不足[20]，用細(xì)胞塊不但可以對(duì)微小組織進(jìn)行組織學(xué)的HE形態(tài)觀察，還可以通過免疫細(xì)胞化學(xué)、原位雜交、熒光原位雜交等技術(shù)解決更多診斷和研究上的問題。細(xì)胞塊技術(shù)的應(yīng)用一方面保證了診斷的準(zhǔn)確性，減輕病理科醫(yī)師的診斷風(fēng)險(xiǎn)，另一方面對(duì)于臨床尋找原發(fā)病灶、對(duì)癥治療有重要的指導(dǎo)作用。

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