松弛素抗纖維化作用的研究進展

朱艷艷(綜述)，張懷勤，周 浩(審校)

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科,浙江 溫州 325000)

松弛素是1926年Hisaw[1]在研究妊娠期間骨盆帶變化時發(fā)現(xiàn)的肽類激素之一，主要由卵巢和妊娠時的胎盤以及雄性動物的前列腺產(chǎn)生,具有松弛盆腔韌帶、擴張子宮頸、抑制子宮收縮等作用，故命名為松弛素。松弛素在細胞分化、增殖、膠原沉積、降解、炎性細胞浸潤、凋亡發(fā)生、擴張血管、調(diào)節(jié)體液平衡等過程中發(fā)揮重要的作用。近年來發(fā)現(xiàn)，松弛素與多種疾病相關(guān)，如癌癥、心血管疾病、纖維化疾病等[2]。

纖維化是指組織內(nèi)實質(zhì)細胞減少、纖維結(jié)締組織增多的過程。細胞外基質(zhì)過度合成和降解減少是其主要機制，其中膠原蛋白是其主要成分。過度組織重構(gòu)和纖維化最終將導(dǎo)致器官功能衰竭。研究證明，心臟和腎臟是松弛素的來源和靶器官[3]。另外，松弛素成功改善了各種動物模型的心臟和腎臟纖維化。因此，松弛素有望用于治療心腎纖維化疾病,并應(yīng)用于臨床。

1 松弛素的結(jié)構(gòu)

松弛素由兩條鏈組成，包括22個氨基酸殘基組成的A鏈和35個氨基酸殘基組成的B鏈，鏈內(nèi)鏈間以二硫鍵相連接。編碼松弛素多肽的基因有三種，分別為H1、H2、H3。H1和H2位于第9號染色體(9p24)，H3基因位于第19號染色體(19p13.3)。其中H2編碼的松弛素是組織儲存以及血液循環(huán)中存在的主要形式。其B鏈正中區(qū)域為受體結(jié)合區(qū)，含有2個精氨酸殘基(精氨酸B13和精氨酸B17)，能與松弛素家族肽類受體RXFP1結(jié)合并在每個精氨酸側(cè)臉產(chǎn)生氫鍵網(wǎng)。第三個氨基酸異亮氨酸殘基B20是至關(guān)重要的RXFP1結(jié)合位點，與RXFP1結(jié)合，產(chǎn)生三角形的“RXXXRXXI”接觸區(qū)域-結(jié)合盒。這個結(jié)合盒中的殘基證明為RXFP1的胞外結(jié)構(gòu)域。A鏈N端形成α螺旋，是沒有功能的?？s短A鏈N端的氨基酸殘基對結(jié)合RXFP1和RXFP2并沒有影響。H2的活性核心是H2(A4-24)(B7-27)[4]。

2 松弛素家族的組織分布

體內(nèi)有多種細胞可分泌松弛素，主要為黃體，其次為蛻膜、胎盤、子宮內(nèi)膜、卵泡內(nèi)膜細胞、卵泡顆粒細胞及乳腺組織。雄性動物的松弛素主要來源于前列腺。嚙齒類動物的大腦、胸腺、心臟和腎臟等部位可表達松弛素[5]。有報道稱，在大鼠心房有高親和力松弛素結(jié)合位點[3]，小鼠腎皮質(zhì)存在松弛素受體表型[6]，人類的心臟也可檢測到松弛素基因轉(zhuǎn)錄的痕跡以及松弛素結(jié)合位點[7-8]。以上研究表明，心臟和腎臟是潛在的松弛素來源和靶器官。

3 松弛素受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

松弛素受體為富含五個平面折疊的多個亮氨酸序列(leurine rich repears，LRRs)的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體，LGR7、LGR8、GPCR135、CPCR142為RXFP1～4。其中RXFP1和RXFP2是主要受體，都包含低密度脂蛋白α、LRRs、跨膜域的外側(cè)襻。LRRs是松弛素與其受體的高親和力結(jié)合位點。松弛素與LRRs區(qū)結(jié)合改變RXFP1的外側(cè)區(qū)域的構(gòu)象，進而促使低密度脂蛋白α與G蛋白偶聯(lián)并活化腺苷酸環(huán)化酶。H2與RXFP1和RXFP2都可以結(jié)合，但H3只能作用于RXFP1[5]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，松弛素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及多條通路，如環(huán)腺苷酸信號途徑，促分裂原活化的蛋白激酶信號[9]，一氧化氮信號途徑[9-10]，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix matalloproteinase,MMP)信號[11-12]，糖皮質(zhì)激素受體途徑[13]。其中與纖維化調(diào)節(jié)相關(guān)的主要是cAMP信號、一氧化氮信號和MMP信號。

3.1cAMP信號 可通過Gi和Go偶聯(lián)調(diào)節(jié)cAMP/蛋白激酶A通路：松弛素激活后可結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體激活GS(G蛋白分為Gs、Gi、Gq和G124大類)蛋白，激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶，而刺激一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)使一氧化氮的產(chǎn)生增加。在大鼠心房，Gi/Go抑制劑可抑制松弛素誘導(dǎo)cAMP[9]。另外，還可通過酪氨酸受體防止cAMP積累。

3.2一氧化氮信號 松弛素可通過Gβγ亞基和3-磷酸肌醇通路直接激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，通過cAMP通道激活蛋白激酶A從而活化IκB，因此通過炎性細胞因子核因子κB增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達，抑制心室肥大纖維化作用。松弛素還可通過與RXFP結(jié)合，引起血管內(nèi)皮的MMP的活性增加， MMP-2和MMP-9可以水解大內(nèi)皮素的甘氨酸亮氨酸鍵產(chǎn)生內(nèi)皮素1-32，而內(nèi)皮素1-32又可以增強內(nèi)皮細胞內(nèi)皮素B受體-一氧化氮舒張血管通路[10]。

3.3MMP信號 松弛素通過與RXFP結(jié)合，引起血管內(nèi)皮的MMP活性增加，MMP可促進膠原降解，MMP-1(膠原酶)切割3/4和1/4膠原片段，MMP-3和MMP-10能作用于蛋白多糖、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白、Ⅲ型和Ⅳ型膠原及明膠。MMP-7能作用于明膠和纖維粘連蛋白，MMP-9可作用于明膠。因此，MMP和金屬蛋白酶組織抑制劑的比例降低可能影響心室重構(gòu)[12]。MMP-2可切割Ⅰ型膠原蛋白，以及纖維連接蛋白和非纖維狀膠原蛋白[11]。

4 心腎纖維化機制

成纖維細胞具有快速增殖、生成大量纖維連接蛋白和各種膠原(尤其是膠原Ⅰ和Ⅲ)的能力，故長期以來認為其在纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。成纖維細胞有四個來源：固有的組織成纖維細胞或血管周圍和血管外膜的成纖維細胞，骨組織遷移的骨髓源性纖維細胞，上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化和內(nèi)皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelium-mesenchymal transformation，EndMT)。其中后兩者在纖維化組織中成為成纖維細胞的重要來源。上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細胞松動細胞與細胞間的黏附結(jié)構(gòu)，包括黏附路口和橋粒，調(diào)節(jié)其極性，重新安排細胞骨架中間絲切換細胞角蛋白至波形蛋白，在心肌纖維化中主要是指心外膜源性細胞的上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用[14]。EndMT是指內(nèi)皮細胞改變其極性、形狀并遷移到周圍組織，伴隨著內(nèi)皮細胞標志的喪失，如CD31，血管內(nèi)皮細胞-鈣黏蛋白，并表達間質(zhì)細胞標志，如α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白、前膠原Ⅰ和成纖維細胞特定蛋白1[15]。

Goumans等[16]首次在纖維化的心臟中發(fā)現(xiàn)EndMT，并有相關(guān)實驗證明了EndoMT由轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號介導(dǎo)。2007年，Zeisberg等[15]研究證明了EndoMT在三個慢性纖維化腎臟疾病小鼠模型中(單側(cè)輸尿管梗阻性腎病、鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病腎病、Alport腎臟疾病)可促進積累激活成纖維細胞和肌纖維母細胞，且TGF-β通路抑制劑和SIS3(Smad3抑制劑)可阻斷EndoMT的作用，減少腎臟纖維化，延緩腎病進展。另有研究顯示，TGF-β可通過其受體(活化素受體樣激酶4，5，7)導(dǎo)致Smad2和Smad3的磷酸化，并誘導(dǎo)EndoMT 至心腎纖維化[17]。

5 松弛素抗心腎纖維化機制

松弛素對膠原纖維的合成和降解都有明顯的影響：一方面松弛素可通過抑制由血管緊張素Ⅱ或TGF-β刺激的膠原合成，膠原沉積，成纖維細胞分化，抑制α-SMA刺激的成纖維細胞活化，抑制血管緊張素Ⅱ和胰島素樣生長因子1刺激的成纖維細胞的增殖[11,18]；另一方面它能夠提高MMP的表達，并抑制金屬蛋白酶組織抑制因子的表達，增強膠原纖維降解[9]。TGF-β是一個促纖維化的細胞因子，在纖維化中起著重要的作用，而松弛素抑制TGF-β已得到充分的證實[11,19-20]。

松弛素在各器官纖維化中均可發(fā)揮一定的抗纖維化作用，尤其是心臟和腎臟。研究發(fā)現(xiàn)，松弛素基因剔除(松弛素-/-雄性小鼠可出現(xiàn)年齡相關(guān)性多器官纖維化，包括心臟和腎臟[3]。12個月雄性松弛素-/-小鼠左心室膠原含量和濃度以及腎臟膠原濃度較野生型高。對心腎纖維化的12個月大的松弛素-/-小鼠輸注2周重組H2松弛素，成功降低了膠原沉積。可見松弛素是極為重要的抗心腎纖維化因子。在自發(fā)性高血壓大鼠模型中，松弛素可顯著降低左心室膠原、腎的膠原蛋白含量，且增加MMP-2水平，說明松弛素可同時改善心臟和腎臟的纖維化[21]。

5.1松弛素抗心肌纖維化 在心肌組織中松弛素可通過RXFP1-eNOS-環(huán)鳥苷酸干擾TGF-β1/Smad2通路抑制EndMT的發(fā)生。松弛素可通過Gβγ亞基和磷脂酰肌醇激酶通路直接激活eNOS并催化生成一氧化氮[9]。長期以NOS抑制劑左旋硝基精氨酸甲基酯阻斷一氧化氮的大鼠可導(dǎo)致TGF-β1上調(diào)以及心臟纖維化和重構(gòu)[22-23]。Leask[24]注意到通過eNOS的傳遞增加一氧化氮的表達可顯著減少心肌梗死后大鼠的心肌纖維化，且與對照組相比TGF-β的血漿水平較低。以上研究表明，在心肌組織中松弛素可通過一氧化氮途徑干擾TGF-β1/Smad2通路抑制EndMT發(fā)生。

松弛素對抗心肌纖維化作用在各個疾病模型研究中已經(jīng)得到充分的證實。持續(xù)滴注松弛素 2周或松弛素基因由病毒結(jié)構(gòu)傳遞，在心肌病、高血壓、異丙腎上腺素引起的心臟毒性、糖尿病心肌病和心肌梗死模型中可持續(xù)抑制或逆轉(zhuǎn)心臟纖維化[25]。在心肌細胞過度表達β2腎上腺素受體的模型中，基質(zhì)重構(gòu)和纖維化構(gòu)成心肌病表型的早期病理過程，靜脈推注腺病毒介導(dǎo)的松弛素基因(Ad-Rln)，2周內(nèi)可觀察到有效的逆轉(zhuǎn)心肌纖維化[3，18]。H3松弛素也可以減弱異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌梗死后松弛素治療可以明顯減少梗死區(qū)和交界區(qū)膠原纖維的致密度，而對左心室功能和左心室重構(gòu)并無不利影響[26]?？梢?，松弛素只對抗患病的心肌纖維化，而并不影響未受影響的心肌區(qū)域的基礎(chǔ)膠原表達，提示松弛素是一個安全且有效的抗纖維化的激素[27]。

5.2松弛素抗腎臟纖維化機制 在腎臟，松弛素通過RXFP1-神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)-一氧化氮-環(huán)鳥苷酸依賴途徑抑制TGF-β1/Smad2信號介導(dǎo)的EndMT。松弛素結(jié)合RXFP1刺激cAMP短暫升高，通過Gαs和GαoB蛋白增加胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的磷酸化，激活nNOS-一氧化氮-環(huán)鳥苷酸依賴通路，抑制Smad2磷酸化抑制TGF-β1信號。nNOS、一氧化氮和環(huán)鳥苷酸抑制劑可阻斷松弛素對α-SMA和Smad磷酸化的抑制作用，而左旋硝基精氨酸甲基酯可顯著阻斷松弛素在體內(nèi)對膠原的抑制作用[5]。松弛素通過抑制Smad2、Smad3磷酸化以及其與Smad4復(fù)合物從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核，反過來抑制Smad2、Smad3配合物形成，使其與TGF-β信號失去聯(lián)系從而抑制TGF-β誘導(dǎo)肌成纖維細胞分化，膠原合成，而對Smad3、Smad4、Smad7磷酸化或易位或調(diào)節(jié)c-Jun NH2-終端酶1/2，細胞外信號相關(guān)蛋白激酶或p38絲裂原活化蛋白激酶則無影響[3,6]。上述研究結(jié)果表明，松弛素可抑制病變部位的TGF-β1介導(dǎo)的肌纖維母細胞分化，膠原過表達，而不影響基礎(chǔ)表達，在健康部位可預(yù)防異常纖維化。

松弛素對抗腎臟纖維化的作用在各個腎臟疾病模型研究中也已得到充分的證實。在單側(cè)輸尿管梗阻大小鼠模型中，單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后膠原、α-SMA表達顯著升高,單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)前4 d給予重組H2松弛素預(yù)處理可改善術(shù)后4 d總膠原、Ⅳ型膠原并抑制TGF-β2生成和細胞增殖；在單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)后第10日，松弛素 mRNA表達下降了80%[28]。可見松弛素可作為腎小管間質(zhì)纖維化的一個調(diào)節(jié)因子，是腎臟疾病進展的標志。溴乙胺模型研究發(fā)現(xiàn)，可引起嚴重的腎間質(zhì)纖維化，腎小球濾過率下降，蛋白尿形成，而松弛素治療組溴乙胺大鼠血清肌酐水平正常，白蛋白排泄率略下降，且在皮髓交界區(qū)，間質(zhì)纖維化顯著下降，也平行減少了TGF-β1的免疫反應(yīng)，巨噬細胞浸潤和保護腎小球濾過率[19]。在抗腎小球基膜腎炎模型中，松弛素可降低血清肌酐、尿蛋白，降低腎小球硬化和間質(zhì)纖維化[20]。以上腎臟疾病模型實驗充分證明了松弛素是一種有效的抗腎臟纖維化因子。

6 展 望

目前從不同的方面證實了松弛素具有抑制心、腎纖維化的作用，同時重組人松弛素也已經(jīng)過了Ⅰ期[22]、Ⅱ期[29]、Ⅲ期[30]臨床試驗，且得到了良好的效果，因此重組人松弛素有望成為臨床治療心、腎纖維化的重要藥物。有報道稱，松弛素可作為男性終末期腎病的死亡風(fēng)險因子，男性終末期腎病患者所有死亡風(fēng)險與松弛素水平呈線性關(guān)系，松弛素每增加5 ng/L可增加心血管的死亡風(fēng)險[30]，可見松弛素不僅可作為治療藥物，而且可作為評估心腎疾病預(yù)后的指標。但目前研究成果有限，仍需不斷探索，繼續(xù)研究。

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