TFPI-2對動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定相關(guān)因素影響的研究進(jìn)展

于 佳(綜述)，羅心平，倪喚春(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200040)

組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)2最初被稱為胎盤蛋白5，是近來發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸蛋白酶抑制劑[1]。1979年，Jandial等[2]首次在雙胞胎妊娠者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該蛋白并將其命名為胎盤蛋白5[2]，后來研究發(fā)現(xiàn)胎盤蛋白5與TFPI的氨基酸序列具有高度同源性,且兩者性質(zhì)具有一定相似性，故最終命名為TFPI-2[3]。TFPI-2參與調(diào)控組織因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的功能，影響粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，該文就TFPI-2對動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定相關(guān)因素作用的研究進(jìn)展予以綜述。

1 TFPI-2的體內(nèi)表達(dá)及分布

人TFPI-2基因位于染色體7q22，全長約7 kb，包括5′非編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)基因和3′非編碼區(qū)，5′非編碼區(qū)含有多個順式作用元件，結(jié)構(gòu)基因含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，內(nèi)含子和外顯子之間的交界處遵循GT-AG規(guī)律(是指在內(nèi)含子和外顯子交界處有兩個相當(dāng)短的保守序列：5′端為GT,3′端為AG)[4]。TFPI-2基因的啟動子區(qū)域富含GC，缺乏典型的TATA和CAAT盒，3個轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)已被識別[5]。TFPI-2基因的啟動子保持持家基因的典型特點(diǎn)，Hubé等[6]發(fā)現(xiàn)，TFPI-2基因的啟動子內(nèi)核因子1、核因子κB和egr-1/Sp1結(jié)合位點(diǎn)高度保守，推測對TPFI-2的誘導(dǎo)性表達(dá)調(diào)控具有重要作用。

TFPI-2廣泛分布于人體組織，包括胎盤、肝臟、骨骼肌、心臟、腎臟和胰腺等。多種細(xì)胞可合成分泌TFPI-2，包括內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞等，內(nèi)皮細(xì)胞合成的60%～90%TFPI-2直接分泌至細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)。

TFPI-2在動脈粥樣硬化組織中表達(dá)量增加。Crawley等[7]發(fā)現(xiàn)在正常人血管內(nèi)，TFPI-2僅表達(dá)于血管內(nèi)皮，而在動脈粥樣硬化組織中，TFPI-2表達(dá)于巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC，培養(yǎng)人主動脈VSMC、U937細(xì)胞(單核細(xì)胞)和Jurkat細(xì)胞株可獲得TFPI-2進(jìn)一步明確以上結(jié)論。

TFPI-2同時存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，亦可能在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。Kempaiah等[8-9]發(fā)現(xiàn)外源性和內(nèi)源性TFPI-2均可在核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在TFPI-2的191～211殘基間存在二連核定位信號序列，推測TFPI-2通過核定位信號與輸入蛋白α形成胞質(zhì)復(fù)合體后與輸入蛋白β相互作用，輸入蛋白β作為分子伴侶協(xié)助三元復(fù)合體通過核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核，提示TFPI-2可能在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能。

2 TFPI-2抑制體內(nèi)蛋白酶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

TFPI-2是一類Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，相對分子質(zhì)量為32×103，由235個氨基酸組成。TFPI-2蛋白結(jié)構(gòu)包括短N(yùn)端、3個串聯(lián)Kunitz結(jié)構(gòu)域(KD)、富含基本氨基酸的C端。KD1可抑制多種絲氨酸蛋白酶活性，包括組織因子/FⅦa復(fù)合體、TⅪa、胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽釋放酶以及纖溶酶等，該蛋白酶的選擇性抑制作用通過精氨酸殘基(R24)實(shí)現(xiàn)，R24組成的P1殘基是以上蛋白酶的識別位點(diǎn)[10-11]。KD1對纖溶酶的抑制作用特異性差，KD1在抑制內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑的同時也能抑制纖溶酶，其抗凝血作用減弱抗纖溶作用，如果將KD1的Leu-17殘基改為Arg后，其抗纖溶作用增強(qiáng)但不再具有抗促凝作用[12]。KD2亦參與纖溶酶活性抑制過程，研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化病變處，TFPI-2、高分子量緩激肽、激肽原結(jié)合蛋白(gC1Qr/p33)的分布相似，gC1Qr/p33參與凝血等過程，提示TFPI-2依賴KD2與gC1Qr/p33形成特異性結(jié)合從而減弱TFPI-2對纖溶酶活性的抑制作用[13]。此外，KD2對FⅩa活性亦有抑制作用。KD3參與結(jié)合脂蛋白，形成游離TFPI-2，具有肝素結(jié)合位點(diǎn)，對肝素鈣具有活性，可結(jié)合蛋白S，增強(qiáng)對FⅩa的抑制作用[14]。C端具有糖基磷脂酰肌醇錨定位點(diǎn)，以直接糖基磷脂酰肌醇介導(dǎo)的膜錨定方式在細(xì)胞表面定位[15-16]。

3 TFPI-2對動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定相關(guān)因素的影響

動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊以巨大脂質(zhì)核心、炎性細(xì)胞聚集、薄的纖維帽為特征。隨著斑塊炎癥的進(jìn)展，MMP引起的凋亡和基質(zhì)降解的作用突出，病變內(nèi)壞死物質(zhì)堆積、炎性纖維帽變薄，斑塊炎癥還造成氧化損傷增加。缺氧誘導(dǎo)斑塊內(nèi)微血管的病理性增生，導(dǎo)致外膜微血管延伸通過中膜直至斑塊，這些新生病理性微血管構(gòu)成的內(nèi)皮完整性很容易受破壞后形成外漏和斑塊內(nèi)出血，斑塊內(nèi)凝血酶原激活物形成、凝血瀑布啟動，進(jìn)而斑塊穩(wěn)定性下降。由此可見，內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的功能、VSMC增殖狀況、MMP及凝血酶活性是動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的重要相關(guān)因素。TFPI-2對纖溶酶、血漿激肽釋放酶、MMP、組織因子/FⅦa復(fù)合體、FⅨa、組織蛋白酶G等具有較強(qiáng)的抑制作用，已有不少文獻(xiàn)研究TFPI-2在動脈粥樣硬化過程中的作用。

3.1TFPI-2與基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP是一類Zn2+依賴性蛋白內(nèi)肽酶，以酶原形式分泌，經(jīng)其他絲氨酸蛋白酶，如纖溶酶激活后具有降解ECM蛋白的作用，與血管重塑過程保持協(xié)調(diào)，MMP系統(tǒng)失調(diào)控是斑塊破裂的重要因素之一。MMP家族包含25個酶，具有不同底物活性。病理學(xué)研究顯示間質(zhì)膠原酶，即MMP-1在動脈粥樣硬化斑塊的纖維帽和肩部區(qū)域大量表達(dá)[17]。溶基質(zhì)蛋白酶1，即MMP-3作用底物廣泛，被認(rèn)為是其他MMP家族成員的上游活化劑，免疫組織化學(xué)分析顯示MMP-3對VSMC增殖和結(jié)締組織重塑過程非常重要，與動脈粥樣硬化和斑塊破裂相關(guān)[18]。明膠酶B，即MMP-9具有降解Ⅳ型膠原活性，促使VSMC遷移，MMP-9在動脈粥樣硬化斑塊破裂處高度表達(dá)。動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的各種細(xì)胞尤其是轉(zhuǎn)化為合成型的VSMC表達(dá)多種MMP，如MMP-1、-2、-3、-9、-14等，而TFPI-2原位表達(dá)與MMP水平呈負(fù)相關(guān)。

TPIF-2間接調(diào)控MMP活化。Rao等[19]發(fā)現(xiàn)TFPI-2可抑制纖溶酶和胰蛋白酶，將相對分子質(zhì)量為53×103的proMMP-1轉(zhuǎn)化為部分活化型43×103的多肽、將相對分子質(zhì)量為66×103的proMMP-3轉(zhuǎn)化為活化型45×103多肽的過程，實(shí)現(xiàn)間接調(diào)控MMP-1和MMP-3催化基質(zhì)的酶解。Du等[20]研究TFPI-2抑制MMP的結(jié)構(gòu)區(qū)域，免疫沉淀和配體印記結(jié)果顯示，TFPI-2并不能與MMP-2、-9、-1和活化MMP-1形成雙分子復(fù)合物，TFPI-2對活化MMP-1酶解三螺旋膠原的活性沒有影響，提示在體內(nèi)TFPI-2可能不是直接調(diào)控MMP-1介導(dǎo)的ECM降解，而是調(diào)控胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活化proMMP的過程。

TFPI-2直接抑制MMP活性。Herman等[21]研究證實(shí)，TFPI-2是MMP抑制劑，強(qiáng)烈抑制MMP-1和MMP-13降解三螺旋膠原的活性，而三螺旋膠原是動脈粥樣硬化斑塊ECM的主要承載分子，TFPI-2對MMP-2和MMP-9活性也有弱抑制作用。Zhao等[22]發(fā)現(xiàn)，TFPI-2過表達(dá)可抑制人源氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)MMP-2、-9活性。Pan等[23]研究apoE-/-小鼠發(fā)現(xiàn)，TFPI-2過表達(dá)可抑制MMP以提供動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。

3.2TFPI-2與凝血酶 凝血酶是專一性很強(qiáng)的絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶，可直接催化纖維蛋白原為纖維蛋白，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放MMP和表達(dá)黏附分子，刺激VSMC增生和遷移，造成內(nèi)皮功能紊亂，凝血系統(tǒng)活性增加，纖維蛋白溶解系統(tǒng)活性降低，血管性血友病因子、組織因子等促凝活性物質(zhì)過度激活，血液處于高凝狀態(tài)，增加血栓形成危險，促進(jìn)動脈粥樣硬化形成和斑塊不穩(wěn)定。

凝血酶上調(diào)TFPI-2表達(dá)，但其具體機(jī)制尚未明確。Neaud等[24]發(fā)現(xiàn)凝血酶通過環(huán)加氧酶2依賴、上皮生長因子受體非依賴介導(dǎo)機(jī)制，上調(diào)TFPI-2的mRNA和蛋白表達(dá)。Pou等[25]研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞和人單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞的TFPI-2表達(dá)增加1.9倍和2.3倍，同時胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和c-Jun氨基端激酶磷?；虸κB水平增加，結(jié)合已知TFPI-2基因啟動子區(qū)域具有核因子κB結(jié)合位點(diǎn)，IκB磷?；?jīng)IκB催化，IκB激酶可由胞外信號調(diào)節(jié)激酶1等多個激酶激活，因此推測，凝血酶通過磷?；庑盘栒{(diào)節(jié)激酶1/2和c-Jun氨基端激酶最終激活核因子κB的途徑誘導(dǎo)TFPI-2表達(dá)，同時研究結(jié)果不支持表皮生長因子、轉(zhuǎn)錄因子激活子蛋白1、環(huán)加氧酶2參與作用機(jī)制。凝血酶生成增加可能是動脈粥樣硬化嚴(yán)重的標(biāo)志。Borissoff等[26]研究顯示，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者體內(nèi)凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物血漿水平顯著升高，體內(nèi)凝血酶生成與動脈粥樣硬化嚴(yán)重度之間具有獨(dú)立相關(guān)性，提示凝血酶在動脈粥樣硬化進(jìn)程中可能起作用。

3.3TFPI-2與脂蛋白 高水平LDL、低水平HDL是形成動脈粥樣硬化斑塊的危險因素之一，在動脈粥樣硬化進(jìn)程中ox-LDL集聚是一個重要步驟。Llaverias等[27]發(fā)現(xiàn)家族性混合型高脂血癥患者單核細(xì)胞內(nèi)TFPI-2表達(dá)升高，推測TFPI-2表達(dá)受HDL水平調(diào)控，極低密度脂蛋白過度生成和血漿高水平是該病的主要特點(diǎn)之一，但是進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)極低密度脂蛋白并不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)TFPI-2。Zhao等[22]研究顯示，ox-LDL可下調(diào)VSMC的TFPI-2表達(dá)，造成不利斑塊穩(wěn)定環(huán)境。

3.4TFPI-2與血管平滑肌細(xì)胞 動脈粥樣硬化斑塊處大量VSMC活化并合成基質(zhì)，分布于VSMC的TFPI-2更受關(guān)注。TFPI-2調(diào)控VSMC的增殖和遷移。Shinoda等[28]發(fā)現(xiàn)，TFPI-2誘導(dǎo)VSMC增生和形態(tài)學(xué)改變，提出TFPI-2是VSMC的促細(xì)胞分裂劑。Zhao等[22]發(fā)現(xiàn)，TFPI-2過表達(dá)可強(qiáng)烈抑制VSMC的增殖和遷移，推測可能與其作為絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制MMP-2、-9的活性相關(guān)，也可能通過對細(xì)胞周期蛋白D1及細(xì)胞增殖遷移相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)、黏著斑激酶、STATS磷酸化的抑制。

TFPI-2對VSMC的作用受流體應(yīng)切力影響。Ekstrand等[29]研究顯示，鼠頸動脈球囊損傷后新生內(nèi)膜內(nèi)的VSMC暴露于流體應(yīng)切力環(huán)境時，VSMC同時表達(dá)TFPI-2和胱天蛋白酶3，TFPI-2的mRNA和蛋白表達(dá)量增加，推測流體應(yīng)切力影響VSMC基因表達(dá)從而抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡，通過調(diào)控VSMC增殖存活來參與修復(fù)血管壁。

3.5TFPI-2與內(nèi)皮細(xì)胞 血管新生時ECM的重塑主要通過細(xì)胞周圍纖溶酶依賴性蛋白酶解和MMP作用，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的TFPI-2在ECM內(nèi)顯著分布，可抑制纖溶酶和MMP活性。TFPI-2抑制血管新生。Xu等[30]研究TFPI-2在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控以及對內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子以絲裂原-細(xì)胞外激酶依賴的方式誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TFPI-2的mRNA和蛋白，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)重組TFPI-2可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用，重組KD1可抑制血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的遷移但對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的增殖無抑制作用，TFPI-2可抑制血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的胞外信號調(diào)節(jié)激酶和Akt的活化，這些結(jié)果提示了TFPI-2通過直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞起到抗血管形成的作用，是TFPI-2對血管新生疾病的潛在治療作用機(jī)制。TFPI-2抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移。Ivanciu等[31]研究TFPI-2表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管發(fā)生的作用，發(fā)現(xiàn)遷移中的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)更多TFPI-2的mRNA和蛋白，另外腺病毒介導(dǎo)的TFPI-2過表達(dá)可減少新生血管形成、促進(jìn)ECM降解和促進(jìn)凋亡，同時纖維蛋白原缺如，推測TFPI-2通過抑制纖溶酶來抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移。

3.6TFPI-2與巨噬細(xì)胞 巨噬細(xì)胞不斷吞噬ox-LDL后最終變?yōu)榕菽?xì)胞，并產(chǎn)生一系列趨化分子等募集更多炎性細(xì)胞，加速動脈粥樣硬化發(fā)展。TFPI-2促進(jìn)巨噬細(xì)胞細(xì)胞凋亡。凝血酶等刺激因素可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的TFPI-2表達(dá)量增加，而重組TFPI-2可通過Fas/FasL信號通路促使U937來源巨噬細(xì)胞的凋亡，提示TFPI-2可能具有抗致動脈粥樣硬化作用[25,32]。

4 小 結(jié)

TFPI-2是一類相對分子質(zhì)量為32×103的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞，在動脈粥樣硬化斑塊處高度分布。TFPI-2抑制MMP活性，使其無法水解胞外基質(zhì)中的大分子物質(zhì)，減少胞外基質(zhì)降解，因此TFPI-2作為MMP內(nèi)源性抑制物在維持和調(diào)節(jié)ECM重塑過程中起關(guān)鍵作用，具有穩(wěn)定粥樣硬化斑塊的作用。此外，還抑制內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等的增殖和遷移，促進(jìn)巨噬細(xì)胞細(xì)胞凋亡，從而延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)展，保護(hù)斑塊穩(wěn)定性。TFPI-2在動脈粥樣硬化發(fā)展中的信號調(diào)控機(jī)制和功能研究日漸深入，必將展現(xiàn)廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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