代謝組學(xué)在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展

李 姣 綜述;周京琳，丁 一 審校

(四川成都610041:1.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙周科;2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頜面外科)

代謝組學(xué)(metabonomics/metabolomics)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的研究生物體或細(xì)胞代謝產(chǎn)物譜變化的一種新的系統(tǒng)方法［1］，它作為一種新興的組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)共同構(gòu)成了系統(tǒng)生物學(xué)［2］，這些組學(xué)分別研究生命過程的不同層面，從而更深層次地認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象及其發(fā)展規(guī)律，探討生命的本質(zhì)。近年來，隨著硬件儀器檢測效率的不斷提高、分析方法和軟件的不斷改進(jìn)升級(jí)，全面加快了從高通量樣品分析到完成海量數(shù)據(jù)分析的整個(gè)研究過程，從而使代謝組學(xué)逐漸成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、病理機(jī)制、疾病診斷等方面的研究熱點(diǎn)。代謝組學(xué)近年來也被引入口腔醫(yī)學(xué)進(jìn)行探索性研究，并取得一定的研究成果，本文就代謝組學(xué)的理論基礎(chǔ)、研究方法及其在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 代謝組學(xué)的理論基礎(chǔ)及優(yōu)勢

生物體是一個(gè)完整復(fù)雜的系統(tǒng)，其生物分子組織和調(diào)控水平相互關(guān)聯(lián)、相互依賴，并受內(nèi)外環(huán)境等因素的影響，每個(gè)部位的變化都可引發(fā)局部或整體生命活動(dòng)的變化，從而引起生物體代謝產(chǎn)物的改變。代謝組學(xué)可對(duì)某一生物體或細(xì)胞在一特定時(shí)期內(nèi)所有低分子量(MW＜1 000 Da)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，并以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)，研究生物體或細(xì)胞的動(dòng)態(tài)代謝變化，特別是內(nèi)源代謝、遺傳變異、環(huán)境變化以及各種物質(zhì)進(jìn)入代謝系統(tǒng)的特征和影響［2］。通過代謝組學(xué)研究既可以發(fā)現(xiàn)生物體在受到各種內(nèi)外環(huán)境擾動(dòng)后的應(yīng)答不同，也可以區(qū)分同種不同個(gè)體之間的表型差異;并能用反映整體的代謝物譜圖直接展現(xiàn)生理或病理狀態(tài)，提供區(qū)別于其他“組學(xué)”所帶來的大量生化信息。與其他“組學(xué)”相比，代謝組學(xué)具有以下優(yōu)勢:①基因和蛋白表達(dá)的微小變化會(huì)在代謝物水平得到放大，更易于檢測出;②代謝組學(xué)的研究不需要進(jìn)行全基因組測序或建立大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫;③代謝物的種類遠(yuǎn)少于基因和蛋白的數(shù)目;④因所有生物體的代謝物種類相同，研究中采用的技術(shù)更通用［3］。

2 代謝組學(xué)的研究方法

代謝組學(xué)的研究步驟包括:樣本的采集和預(yù)處理、代謝產(chǎn)物檢測和數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理和分析、生物標(biāo)志物識(shí)別和代謝途徑分析。這里僅對(duì)檢測技術(shù)和分析方法做簡要介紹。

2.1 檢測技術(shù)

完成樣本的采集和預(yù)處理后，需要對(duì)樣本中的代謝物進(jìn)行檢測。與其他組學(xué)技術(shù)只分析檢測特定類型的化合物不同，由于代謝組學(xué)所分析檢測的化合物在大小、數(shù)量、官能團(tuán)、揮發(fā)性、帶電性、電遷移率、極性以及其他物理化學(xué)參數(shù)方面的差異很大，所以要求其檢測方法應(yīng)具有高靈敏度、高通量和無偏向性的特點(diǎn)。用于代謝組學(xué)研究的檢測技術(shù)有核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)、氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、毛細(xì)管電泳(CE)、紅外光譜(IR)、電化學(xué)檢測(ECD)及其組合聯(lián)用等各種手段。但由于代謝產(chǎn)物和生物體系的復(fù)雜性，目前尚無一種技術(shù)能滿足上述所有的要求，因此越來越多的學(xué)者均推薦采用聯(lián)用技術(shù)或多種方法綜合分析［4-6］。

NMR是當(dāng)前代謝組學(xué)研究中的主要技術(shù)，其優(yōu)勢在于能夠?qū)颖緦?shí)現(xiàn)無創(chuàng)性、無偏向的檢測，而且樣本預(yù)處理相對(duì)簡單，具有較高的通量和較低的單位樣本檢測成本;并能分別檢測化合物中的1H、2H、13C、31P、15N、19F 等核素。另外，由于其中的1H-NMR對(duì)含氫化合物均有響應(yīng)，所得氫譜的譜峰與樣本中各化合物一一對(duì)應(yīng);譜圖中信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱可反映樣品中各代謝物結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，因此能完成樣品中大多數(shù)化合物的檢測，從而滿足代謝組學(xué)研究中對(duì)盡可能多的化合物進(jìn)行檢測的目標(biāo)［1，7］。NMR 的缺點(diǎn)是:與 MS相比檢測靈敏度相對(duì)較低，檢測動(dòng)態(tài)范圍有限，低豐度代謝物信號(hào)易受到高豐度代謝物信號(hào)的掩蓋。

與NMR相比MS具有較高的靈敏度和特異性，適于大量低豐度代謝物的分析鑒定。隨著質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，多數(shù)學(xué)者已將色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Chromatography-Mass Spectrometry)用于代謝組學(xué)的研究［5-6，8］。GC-MS 在植物學(xué)、疾病診斷等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，該技術(shù)不僅具有較高的分辨率和檢測靈敏度，同時(shí)還有可供參考比較的標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫，使之易于得到待分析代謝組分的定性結(jié)果。但應(yīng)用GC-MS進(jìn)行檢測時(shí)，需要先對(duì)樣本進(jìn)行衍生化預(yù)處理，不僅其步驟繁瑣，且會(huì)導(dǎo)致樣本易產(chǎn)生變化，不能分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)和一些大分子代謝產(chǎn)物。LC具有強(qiáng)大的分離能力，基于LC-MS技術(shù)的分析方法十分適合代謝組學(xué)樣本的分析，且該技術(shù)避免了衍生化的步驟，適用于熱不穩(wěn)定、不易揮發(fā)、不易衍生化和分子量較大的物質(zhì)［5，8-9］。

近幾年基于NMR或MS發(fā)展的其他檢測技術(shù)，如高分辨魔角旋轉(zhuǎn)(HR-MAS)［10］、超高效液相色譜/高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/QTOF-MS)［11］、基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOFMS)［12］、傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)［13］、高效液相色譜/電噴霧質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS/MS)［14］、薄層色譜/氣相色譜與氫火焰離子化檢測器質(zhì)譜(TLC/GC-FID-MS)［15］、快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜(REIMS)［16］等也被廣泛用于代謝組學(xué)研究，以提高代謝產(chǎn)物檢測的分辨率、靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍和通量，從而獲得更加準(zhǔn)確和完整的樣本信息。

2.2 分析方法

由上述測試分析儀器導(dǎo)出的是信息含量豐富的多維數(shù)據(jù)，不能直接用于分析，需對(duì)采集的多維海量原始信息進(jìn)行壓縮降維和歸類分析，從中挖掘出有用信息。主要的數(shù)據(jù)預(yù)處理包括濾噪、重疊峰解析、峰匹配、標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化等(但并不是所有步驟都需要進(jìn)行，而是根據(jù)實(shí)際情況選擇幾種)，最后提取出二維矩陣數(shù)據(jù)表，表中的行代表樣品或?qū)嶒?yàn)數(shù)目，列表示相應(yīng)的單個(gè)測定指標(biāo)(通常為代謝物的信號(hào)強(qiáng)度等)［17］。數(shù)據(jù)分析過程中應(yīng)用的主要手段為模式識(shí)別技術(shù)(PRA)，包括非監(jiān)督性模式識(shí)別和監(jiān)督性模式識(shí)別［18-19］。

非監(jiān)督性模式識(shí)別用于預(yù)處理后的數(shù)據(jù)信息中對(duì)樣本進(jìn)行歸類，并采用相應(yīng)的圖表直觀地表達(dá)出來，不需要有關(guān)樣本分類的任何背景信息。該方法將得到的分類信息和這些樣本的原始信息進(jìn)行比較，建立代謝產(chǎn)物與這些原始信息的聯(lián)系，篩選與原始信息相關(guān)的生物標(biāo)志物，進(jìn)而考察其中的代謝途徑，常用的方法是主成分分析(PCA)。

監(jiān)督性模式識(shí)別用于建立類別間的數(shù)學(xué)模型，使各類樣本間達(dá)到最大的分離，并利用建立的多參數(shù)模型對(duì)未知的樣本進(jìn)行預(yù)測(即由已知有效推測未知)，常用的方法是獨(dú)立軟模式分類(SIMCA)和偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)。

PCA和PLS-DA是代謝組學(xué)研究中最常用的模式識(shí)別方法，這兩種方法通常以得分圖(score plot)獲得樣本分類的信息，以載荷圖(loading plot)獲得對(duì)分類有貢獻(xiàn)變量及其貢獻(xiàn)大小，從而發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)志物的變量。目前軟件商或儀器制造商已開發(fā)出多種相關(guān)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理分析軟件，利用這些軟件使得數(shù)據(jù)信息處理過程更加快速和自動(dòng)化［20］。

與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相似，代謝組學(xué)的生物標(biāo)志物識(shí)別和代謝途徑分析均離不開各種生物化學(xué)和代謝途徑數(shù)據(jù)庫。但目前代謝組學(xué)專用數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容和功能并不完善，只能利用其他生化和代謝途徑數(shù)據(jù)庫對(duì)樣本中未知代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定或已知代謝物的生物功能解釋。理想的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫應(yīng)包括各種生物體的代謝物組信息以及代謝物的定量數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)庫中每種代謝產(chǎn)物都有其相應(yīng)的化學(xué)、臨床、分子生物學(xué)和生化數(shù)據(jù)。例如由加拿大阿爾伯塔大學(xué)研究者建立并持續(xù)補(bǔ)充完善的人類代謝組數(shù)據(jù)庫(the human metabolite database HMDB，www.hmdb.ca)［21］，該數(shù)據(jù)庫截止2012年已收錄40 000多種代謝物。

3 代謝組學(xué)在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究應(yīng)用

隨著代謝組學(xué)的不斷發(fā)展，其研究優(yōu)勢和前景被越來越多的學(xué)者所認(rèn)知，在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的相關(guān)研究也日益增加。常用于檢測分析的樣本主要為含有大量代謝產(chǎn)物的生物體液，如血漿(血清)、唾液、齦溝液、尿液、口腔微生物(牙菌斑)培養(yǎng)液以及細(xì)胞培養(yǎng)液。

3.1 口腔致病微生物檢測

Takahashi等［22］利用CE-MS對(duì)齦上菌斑和口腔常見菌(鏈球菌、放線菌)的糖代謝系統(tǒng)的相關(guān)機(jī)理進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，齦上菌斑與鏈球菌、放線菌的代謝途徑和代謝產(chǎn)物相似:均為乙酰輔酶A以及糖酵解途徑中的葡萄糖-6-磷酸、1，6-二磷酸果糖等和磷酸戊糖途徑中的6-磷酸葡萄糖、核酮糖-5-磷酸等增加;糖酵解途徑中的3-磷酸甘油酸酯、磷酸烯醇丙酮酸和三羧酸循環(huán)中的琥珀酸、延胡索酸等減少。

熊萍［23］、魯維希［24］、李兵等［25］分別在液體培養(yǎng)基中接種相同密度的不同齲病、牙周病、黏膜病相關(guān)致病菌，選擇細(xì)菌生長穩(wěn)定期的培養(yǎng)液行1H-NMR檢測，數(shù)據(jù)分析顯示:各組數(shù)據(jù)內(nèi)部均有集中的類聚關(guān)系，可以分別區(qū)分齲病、牙周病、黏膜病相關(guān)致病菌中不同種屬的細(xì)菌，提示代謝組學(xué)在口腔致病微生物的快速鑒定中有良好應(yīng)用前景。

3.2 牙周病

Barnes等［26］分別采集健康、牙齦炎和牙周炎位點(diǎn)的齦溝液，并以LC-MS與GC-MS聯(lián)合的方法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:牙周炎位點(diǎn)的抗氧化劑和谷氨酸減少，嘌呤降解和鳥氨酸循環(huán)增加;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了一些與牙周炎進(jìn)展相關(guān)的生物標(biāo)志物。鑒于嘌呤降解途徑是活性氧產(chǎn)物的主要來源，其明顯加速提示牙周炎引起的氧化應(yīng)激和炎癥是通過該途徑調(diào)節(jié)的，由此作者提出了“細(xì)胞代謝產(chǎn)物的改變是宿主-細(xì)菌相互作用的結(jié)果”這一新的觀點(diǎn)。此后該課題組［27］又分別采集使用三氯生牙膏和普通牙膏后的牙周炎患者的健康、牙齦炎、牙周炎位點(diǎn)處的齦溝液，并對(duì)之前研究中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的10種代謝標(biāo)志物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組最早在第1周時(shí)其牙齦炎位點(diǎn)的肌苷、賴氨酸、腐胺和黃嘌呤水平即出現(xiàn)降低，而對(duì)照組則無改變。以上結(jié)果說明，在出現(xiàn)臨床改變之前三氯生就引起了生物標(biāo)志物的明顯改變，提示通過檢測這些生物標(biāo)志物的水平，可對(duì)疾病的狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估和預(yù)測。

Aimetti等［28］將通過臨床和放射檢查診斷為廣泛型慢性牙周炎患者唾液的1H-NMR數(shù)據(jù)與牙周健康者進(jìn)行分析比較時(shí)發(fā)現(xiàn):與牙周健康者相比，廣泛型慢性牙周炎患者唾液中的醋酸鹽、γ-氨基丁酸等濃度均明顯增高，而丙酮酸鹽、N-乙酰類的濃度則明顯降低。

3.3 口腔癌

Sugimoto等［29］分別收集口腔癌、胰腺癌、乳腺癌、慢性牙周炎患者和健康人的唾液，采用CE-TOF-MS聯(lián)合的方法共認(rèn)定了57種主要代謝產(chǎn)物，經(jīng)分析顯示，3種癌癥患者唾液中所檢測到的多數(shù)標(biāo)志物濃度均明顯高于牙周炎和健康組;提示腫瘤的特征性改變包含在唾液代謝產(chǎn)物中，這些代謝產(chǎn)物有望作為生物指標(biāo)用于疾病的預(yù)測和篩查。

Zhou等［30］采用1H-NMR 對(duì)口腔鱗癌患者和健康人血液代謝物進(jìn)行分析比較時(shí)發(fā)現(xiàn):與健康者相比，口腔鱗癌患者血漿中核苷酸的合成明顯加強(qiáng)，氨基酸和核苷酸的分解代謝顯著降低;糖類的合成也相對(duì)降低，糖酵解異常。

Wei等［11］分別收取口腔鱗狀細(xì)胞癌患者、口腔白斑患者和健康人的唾液樣本，利用UPLC/QTOF-MS進(jìn)行檢測，并從中選取5種已知有意義的生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:3組的代謝物均有明顯差別，其中口腔鱗狀細(xì)胞癌與白斑相比5種標(biāo)志物中的乳酸增加，纈氨酸、苯基丙氨酸減少;提示唾液代謝物檢測可作為臨床上口腔鱗狀細(xì)胞癌和口腔黏膜白斑分級(jí)診斷的輔助檢查，也可作為預(yù)后評(píng)估的參考。

3.4 唇腭裂

Zhou等［31］利用1H-NMR對(duì)孕期分別腹腔注射地塞米松和生理鹽水的C57BL/6J雌鼠的血漿進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J孕鼠在地塞米松干預(yù)下其妊娠過程中的代謝物組發(fā)生了變化，各代謝產(chǎn)物與對(duì)照組相比均有明顯差異，說明地塞米松擾亂母體代謝可能在引發(fā)胎兒唇腭裂中有重要作用;提示利用代謝組學(xué)方法檢測母體孕期代謝變化可以早期發(fā)現(xiàn)胎兒的唇腭裂情況。

3.5 其他

Huang等［12］采用 MALDI-TOF/TOF-MS 研究經(jīng)胰蛋白酶消化后的人唾液蛋白/多肽，并通過搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫鑒定出63種唾液肽與相應(yīng)22種唾液蛋白，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn):帶有脯氨酸(Pro)-谷氨酸鹽(Gln)C-終端(-PQ C-termini)結(jié)構(gòu)的肽類為人唾液中的固有成分，該類多肽能與口腔細(xì)菌結(jié)合并表現(xiàn)出固有免疫的特點(diǎn)，可能對(duì)固有免疫相關(guān)疾病的診斷和預(yù)后評(píng)估有一定意義。

Takeda等［32］利用1H-NMR方法研究健康人群唾液中代謝物濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一非吸煙男性的刺激性唾液中的代謝物濃度均高于其非刺激性唾液;吸煙男性與非吸煙男性相比，唾液中的檸檬酸鹽、乳酸鹽等濃度均增高，甲酸鹽濃度降低;男性與女性相比，唾液中的醋酸鹽、甲酸鹽等濃度均增高。

牙合墊治療(template therapy)可治療顳下頜關(guān)節(jié)紊亂癥、頭痛等多種癥狀和疾病，為研究其治療機(jī)制，Tanaka等［33］利用 CE-TOF-MS對(duì)一名頭痛女性患者治療前和經(jīng)治療癥狀緩解后的唾液進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，治療后唾液中甘氨酸的濃度增加，其他氨基酸無明顯變化，說明甘氨酸在牙合墊治療中具有重要作用。

4 展望

隨著代謝組學(xué)的優(yōu)勢被越來越多的學(xué)者所認(rèn)知，已涉及到許多領(lǐng)域并成為研究熱點(diǎn)。而且該技術(shù)與能與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等相關(guān)研究相結(jié)合，正朝著整合一體化、定量化和標(biāo)準(zhǔn)化的方向發(fā)展?；贜MR或MS開發(fā)的新檢測技術(shù)，改進(jìn)的統(tǒng)計(jì)分析方法以及代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫的不斷補(bǔ)充和完善等發(fā)展趨勢都有助于提高樣本檢測分析的效率和準(zhǔn)確性，并可為今后的分析研究提供更多的便利。由于生物體液中代謝產(chǎn)物的成分復(fù)雜多樣，將代謝組學(xué)與其他組學(xué)相結(jié)合對(duì)樣本中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分類分析(如高豐度蛋白、低豐度蛋白、脂類、糖類等)，以減少不同類物質(zhì)間的信號(hào)干擾、縮小研究范圍，使之更容易尋找出特異性生物標(biāo)志物，可能成為今后代謝組學(xué)研究的一個(gè)方向。通過目前的研究報(bào)道可看出，代謝組學(xué)在口腔疾病的致病機(jī)制研究、風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、篩查、診斷、病理分級(jí)和預(yù)后評(píng)估以及口腔致病微生物的快速鑒定中均顯示出其他研究方法所不具備的優(yōu)勢，尤其在目前研究較少的因全身代謝異常所導(dǎo)致的口腔疾病或遺傳性口腔疾病，以及個(gè)性化用藥指導(dǎo)中均有良好的研究前景，并有望應(yīng)用于臨床。從大量的代謝產(chǎn)物中找出特異性的生物標(biāo)志物(特別是低豐度的標(biāo)志物)是決定該技術(shù)能否在臨床領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一個(gè)重要因素，也是今后代謝組學(xué)研究中需要重點(diǎn)解決的問題。

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