秀麗隱桿線蟲在抗感染研究中的應用

胡淦海，李德東，趙蘭雪，王 彥，姜遠英 (1. 福建中醫(yī)藥大學藥學院中藥學教研室，福建 福州 350108;. 第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，上海 00433)

長期以來，醫(yī)藥領(lǐng)域的科研人員大多應用哺乳動物研究病原微生物的致病機制，然而哺乳動物(如小鼠)作為宿主涉及到倫理學問題，實驗周期長且成本高，無法滿足大規(guī)模高通量、低成本的篩選要求。無脊椎動物模型為病原微生物致病機制研究和抗感染藥物研發(fā)提供了新方案。目前比較成熟的無脊椎動物模型包括秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，簡稱線蟲)[1]、黒腹果蠅(Drosophilamelanogaster)[2]、斑馬魚(zebra fish)[3]等。線蟲模型用于高通量篩選方面有得天獨厚的優(yōu)勢，本文重點對線蟲在抗病原微生物方面的研究進行綜述。

1 線蟲的生理學特點

20世紀60—70年代，Brenner[4]率先將線蟲作為模式生物用于科學研究。線蟲成蟲長約1 mm，直徑約50 μm，分為雌雄同體和雄性個體。每條雌雄同體的成熟期線蟲由959個細胞組成，其中包括302個神經(jīng)細胞，213個皮下細胞和34個腸道細胞。一條雌雄同體的野生型線蟲可生育大約300個后代，若與雄蟲交配則后代更多，可多達上千個。線蟲的平均壽命為2～3周，3～5 d繁殖一代[5]。幼蟲在經(jīng)歷L1，L2，L3，L4這4個階段后長成成蟲。每個階段都需經(jīng)歷蛻皮[6]，當食物供給不足時，幼蟲會進入一種叫作"dauer"的狀態(tài)，這種狀態(tài)下的幼蟲可在干燥及缺乏食物等極端惡劣條件下長時間存活，環(huán)境改善后(如食物供給恢復)，它們經(jīng)蛻皮可恢復為正常的成蟲[6，7]。

2 線蟲在病原菌致病機制研究中的應用

近年來，線蟲在病原菌研究中的應用越來越廣泛，目前已證實有大約35種人類致病菌(包括G+菌，G-菌和真菌)會對線蟲造成感染[8]，其致病機制和致病因子與其在哺乳動物中的表現(xiàn)有極大的相似之處。

2.1線蟲在細菌致病機制研究中的應用

2.1.1金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 是一種常見的G+菌，易造成機體局部感染，嚴重者可危及生命[9]。Garsin等發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌可在線蟲(N2 strain)腸道內(nèi)形成菌落破壞宿主腸道上皮細胞，進而破壞組織器官，導致線蟲死亡[10-12]?？茖W家們已經(jīng)開始用線蟲研究金黃色葡萄球菌的關(guān)鍵致病因子。agr和sarA是金黃色葡萄球菌感染哺乳動物的重要毒力因子，其缺失菌對線蟲的致病力顯著降低，與在哺乳動物模型中的表現(xiàn)相似[12]。

2.1.2糞腸球菌(Enterococcusfaecalis) 是一種存在于人體消化道內(nèi)的條件致病菌，可引起多種疾病，包括感染性心內(nèi)膜炎[13]。Garsin等建立了線蟲(N2 strain)的糞腸球菌持久感染模型[10]。極少量的糞腸球菌即可造成線蟲腸道感染，并導致嚴重的腸道腫脹，在4 d左右的時間里約50%的線蟲死亡[10]。溶菌素cyl是該菌感染線蟲的重要毒力因子[10]。此外，糞腸球菌群體感應應答調(diào)節(jié)因子fsr/gelE-sprE也是導致線蟲感染的重要因素，fsr缺失菌在同樣的實驗條件下對線蟲的致病力大大降低[10，14，15]。糞腸球菌的感染還可導致線蟲體內(nèi)活性氧增加。有研究顯示，線蟲在被感染糞腸球菌的部位有脂褐質(zhì)累積，而脂褐質(zhì)是由氧化損傷產(chǎn)生的天然色素[16，17]。

2.1.3綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa) 是一種人類生活環(huán)境中普遍存在的G-菌。Mahajan-Miklos等發(fā)現(xiàn)該菌導致線蟲發(fā)病的機制與環(huán)境因素有關(guān)[18，19]。在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，綠膿桿菌PA14菌株是通過釋放一種酚嗪類化合物在數(shù)小時之內(nèi)殺死線蟲(N2 strain)，被稱為“快速致死”[18]。 在營養(yǎng)匱乏的培養(yǎng)基中，綠膿桿菌PA14可導致線蟲一種類似哺乳動物腸道感染的病理狀態(tài)，在數(shù)天后殺死線蟲，稱為“緩慢致死”?！熬徛滤馈敝饕蕾囉诰G膿桿菌在腸道中的累積，當感染的細菌數(shù)量達到一定閾值時導致永久性感染，如果感染達不到一定的細菌數(shù)量，線蟲可以恢復健康狀態(tài)[11]。

2.2線蟲在真菌致病機制研究中的應用

2.2.1白念珠菌(Candidaalbicans) 是一種普遍存在于人體內(nèi)的條件致病真菌，當機體免疫力明顯下降時可導致全身感染，嚴重感染時危及生命[20]。白念珠菌可對線蟲(glp-4;sek-1 strain)造成持續(xù)的、致死性的感染[21]?！敖湍笐B(tài)-菌絲態(tài)相互轉(zhuǎn)換”是影響白念珠菌對哺乳動物致病的關(guān)鍵因素[22]。酵母態(tài)和菌絲態(tài)的白念珠菌對線蟲(glp-4;sek-1 strain)均有致病力[23,24]。Pukkila-Worley等發(fā)現(xiàn)白念珠菌的菌絲態(tài)生長可導致線蟲死亡[24,25]。Gantner等發(fā)現(xiàn)，把被感染的白念珠菌的線蟲(N2 strain和fer-15，fem-1 strain)繼續(xù)放在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而不是轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)液中，白念珠菌以酵母態(tài)存在于線蟲的腸道，造成腸道膨脹而使線蟲死亡[26-28]。

線蟲(glp-4，sek-1 strain)感染模型還可用于研究致病菌之間的相互作用，例如白念珠菌與眾多原核生物感染的相互作用[29]。線蟲可在被白念珠菌感染4 h后，再被鮑曼不動桿菌、綠膿桿菌[29]或鼠傷寒沙門菌[30]感染。在上述情況下，某些G-菌可抑制白念珠菌菌絲的形成，而菌絲形成能力的下降，這意味著白念珠菌致病力的降低[29,30]。由此可見，不同的致病菌同時感染線蟲，病原菌之間存在相互作用和相互制約，而線蟲模型為體內(nèi)研究致病菌的相互作用提供了研究平臺。

2.2.2新型隱球菌(Cryptococcusneoformans) 是一種普遍存在于環(huán)境中的具有莢膜的條件致病真菌，它一般呈酵母態(tài)，可致多種動物感染真菌病，尤其在免疫力低下的人群易感[31,32]。將新型隱球菌留存在線蟲(N2 strain)的腸道內(nèi)，可在感染2～7 d后導致線蟲死亡[31,32]，如果在短時間接觸新型隱球菌后就將線蟲轉(zhuǎn)移至正常線蟲培養(yǎng)環(huán)境，新型隱球菌可從線蟲腸道內(nèi)清除，避免發(fā)生感染。莢膜是體現(xiàn)新型隱球菌的關(guān)鍵因素，但有意思的是Mylonakis等發(fā)現(xiàn)，無莢膜的新型隱球菌對線蟲同樣有致病力，而且在營養(yǎng)豐富的BHI培養(yǎng)基中，即使熱滅活的新型隱球菌H99也可導致線蟲的壽命縮短[31]。新型隱球菌導致線蟲感染的機制目前尚不清楚，但其致病機制與對哺乳動物的致病機制存在相通之處[31-33]。gps1或者pka1基因缺失的新型隱球菌在哺乳動物模型上的致病力降低，而pkr1基因缺失的新型隱球菌在哺乳動物模型上的致病力增強；在線蟲感染模型中，各基因缺失菌的結(jié)果與在哺乳動物模型上的結(jié)果一致[32]。

3 線蟲在抗感染藥物篩選中的應用

3.1線蟲在抗細菌藥物篩選中的應用 如上所述，由于多種人類病原體可導致線蟲感染[8-34]，因此可以利用線蟲感染模型來篩選抗菌藥物。Moy等[35]建立了線蟲(glp-4，sek-1 strain)-糞腸球菌感染模型，高通量篩選了6 000個人工合成的化合物以及1 136個天然產(chǎn)物單體化合物，發(fā)現(xiàn)16個合成化合物以及9個天然產(chǎn)物可顯著延長被感染線蟲的存活率。有意義的是，有些化合物在體內(nèi)比體外顯示出更好的活性，可以推測這些化合物可能作用于細菌的毒力因子或者可以改善宿主的免疫應答。16個化合物中15個沒有毒性，僅有1個化合物能使線蟲的生長滯后[35]。Moy等[36]運用改進的篩選方法，對33 931種合成化合物以及3 283種天然產(chǎn)物單體化合物進行了篩選，發(fā)現(xiàn)28種化合物及天然產(chǎn)物具有抗糞腸球菌活性，其中6個化合物雖然能延長線蟲的存活率，但在體外不具有抑制糞腸球菌的活性，這些藥物的作用機制可能與目前的抗生素不同，它們更可能是以一種免疫調(diào)節(jié)劑或者是毒力因子的抑制劑而發(fā)揮作用的[36]。

綠膿桿菌的耐藥性問題日益引起研究人員的關(guān)注。Zhou等[37]建立了線蟲(glp-4，sek-1 strain)-綠膿桿菌感染模型，高通量篩選了1 300種提取物，發(fā)現(xiàn)36個提取物能夠延長感染綠膿桿菌線蟲的壽命，其中僅有4個在體內(nèi)、體外對耐藥綠膿桿菌均具有活性。運用線蟲感染模型來篩選抗菌藥物可發(fā)現(xiàn)很多在體外篩選中落選的候選藥物[37]。

3.2線蟲在抗真菌藥物篩選中的應用 常用的抗真菌藥物對白念珠菌感染的線蟲有顯著的保護作用[21]，可以利用線蟲(glp-4，sek-1 strain)-白念珠菌感染模型來高通量地篩選具有抗真菌活性的化合物[21-38]。Breger等[21]篩選了1 266種化合物，其中15個化合物對白念珠菌感染線蟲有保護作用，線蟲的存活率顯著提高，白念珠菌在線蟲體內(nèi)的菌絲形成能力被明顯抑制。Okoli等[38]對線蟲(glp-4，sek-1 strain)-白念珠菌感染篩選模式進行了改進，篩選了3 228個化合物，其中有1 948個為FDA批準的藥物，其余的1 280個為小分子化合物，研究發(fā)現(xiàn)其中19個化合物對白念珠菌感染線蟲有保護作用，可顯著提高線蟲的存活率。

Coleman等[39]運用線蟲(glp-4，sek-1 strain)-白念珠菌感染模型觀察了2 560種天然皂苷類化合物的抗真菌活性，12種皂苷被證實具有抗真菌活性。研究者對其中2個皂苷A16和A19進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)皂苷A16和A19可以抑制白念珠菌菌絲和生物被膜的形成。溶血實驗顯示，A16和A19皂苷沒有溶血毒性，因此有進一步研發(fā)的價值[39]。

4 結(jié)語

線蟲實驗成本低、周期短，不受倫理學制約，不需要哺乳動物實驗所必需的、煩瑣的審批過程。在篩選具有抗感染活性的化合物研究中，線蟲模型綜合考慮了宿主、病原微生物和藥物三者之間的相互作用，與體外模型相比更有助于發(fā)現(xiàn)高效、低毒的候選新藥。當前，利用線蟲模型篩選抗感染新藥已經(jīng)實現(xiàn)了自動化、高通量[21]，其篩選效率與體外高通量篩選接近。線蟲模型在抗感染研究領(lǐng)域必將有廣泛的應用前景。

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