一起香菇菌棒品種混雜事故的鑒定分析

宋小亞 劉 昆 曾凡清 鄭巧平

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一起香菇菌棒品種混雜事故的鑒定分析

宋小亞 劉 昆 曾凡清 鄭巧平

（麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000）

菌種質(zhì)量；拮抗試驗(yàn)；分子標(biāo)記；成因

香菇是麗水市食用菌產(chǎn)業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)品，菌種質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到香菇產(chǎn)業(yè)的是否可持續(xù)健康發(fā)展。近年來由菌種質(zhì)量問題引發(fā)的生產(chǎn)事故時(shí)有發(fā)生。由于菌種無性繁殖的特點(diǎn)，食用菌產(chǎn)業(yè)有“一支母種影響一個(gè)食用菌產(chǎn)業(yè)”的說法，種源的重要性不言而喻。

2012年5月，麗水市某香菇產(chǎn)區(qū)菇農(nóng)在生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)菌棒有易斷的現(xiàn)象，與往年有明顯的不同。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，部分香菇菌棒有一兩條甚至三條拮抗線，菌棒在拮抗線部位容易斷裂，疑似有不同品種的香菇菌種混雜。筆者選取了典型的有三條拮抗線的菌棒進(jìn)行試驗(yàn)研究，探究其成因，為有針對(duì)性地開展后期栽培管理提供技術(shù)支撐，以期在今后生產(chǎn)中避免或減少出現(xiàn)類似的生產(chǎn)事故。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 選取有4個(gè)接種孔、3條拮抗線的香菇菌棒。以拮抗線為界劃分為4個(gè)樣品，取各樣品中間部位進(jìn)行菌株分離。自袋口開始，4個(gè)分離菌株依次編號(hào)為A、B、C、D。菌棒、拮抗線及分離部位如圖1所示。依據(jù)調(diào)研情況，以事故發(fā)生地菇農(nóng)主栽的高溫品種香菇931和香菇9319為對(duì)照菌株。

圖1 菌株分離示意圖

1.2 試驗(yàn)方法

（1）拮抗試驗(yàn)。①在PDA平板培養(yǎng)基上接種菌株A、B、C、D，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察各菌株菌落交界處是否產(chǎn)生拮抗反應(yīng)。各菌株交換位置重復(fù)驗(yàn)證。②在PDA平板培養(yǎng)基上接種菌株A、B、C、D于對(duì)照菌株周圍進(jìn)行培養(yǎng)，觀察各菌株與對(duì)照菌株菌落交界處是否產(chǎn)生拮抗反應(yīng)。培養(yǎng)條件、拮抗反應(yīng)的觀察和判斷方法參照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1845-2010 食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)［1］。

（2）菌種真實(shí)性鑒定。通過ISSR和RAPD兩種分子標(biāo)記對(duì)菌株A、B、C、D及對(duì)照菌株香菇931和9319進(jìn)行遺傳分析，作出菌株真實(shí)性鑒定。鑒別4個(gè)分離菌株是否一致，以及與對(duì)照菌株之間的關(guān)系。菌絲體培養(yǎng)、DNA模板制備、引物、反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)、數(shù)據(jù)記錄及結(jié)果分析方法，分別參照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1730-2009 食用菌菌種真實(shí)性鑒定 ISSR法［2］和NY/T 1743-2009 食用菌菌種真實(shí)性鑒定 RAPD法［3］。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 拮抗試驗(yàn) 如圖2所示，分離菌株A與C、B與D菌落兩兩之間無拮抗線；A與B、B與C、C與D、D與A菌落交界處菌絲隆起，表現(xiàn)出典型的拮抗反應(yīng)，說明菌株A與B、C與D兩兩之間應(yīng)為不同品種。A與C、B與D兩兩之間可能為同一品種。

圖2 拮抗試驗(yàn)1

圖3 拮抗試驗(yàn)2

如圖3所示，分離菌株A、C與對(duì)照菌株香菇931之間無拮抗反應(yīng)，而與對(duì)照菌株香菇9319之間有明顯的拮抗反應(yīng)；分離菌株B、D與對(duì)照菌株香菇9319之間無拮抗反應(yīng)，而與對(duì)照菌株香菇931之間有明顯的拮抗反應(yīng)。由此可知，菌株A、C和香菇931可能為同一品種，而菌株B、D和香菇9319可能為同一品種。

2.2 菌株真實(shí)性鑒定 從ISSR標(biāo)記對(duì)各菌株的擴(kuò)增結(jié)果（圖4）可以發(fā)現(xiàn)，菌株A、C與香菇931（CK1）的DNA擴(kuò)增條帶高度一致，菌株B、D與香菇9319（CK2）的DNA擴(kuò)增條帶高度一致；菌株A、C、香菇931與菌株B、D、香菇9319的電泳譜帶存在明顯差異。由此說明，菌株A、C與香菇931的遺傳相似性極高，而菌株B、D與香菇9319的遺傳相似性極高。

圖4 菌株ISSR標(biāo)記圖譜（CK為空白對(duì)照，CK1為香菇931，CK2為香菇9319）

從RAPD標(biāo)記得到的分析結(jié)果與ISSR標(biāo)記一致。

綜合拮抗試驗(yàn)和菌株真實(shí)性鑒定試驗(yàn)的分析結(jié)果可以判斷，分離菌株A、C與香菇931應(yīng)為同一品種，菌株B、D與香菇9319應(yīng)為同一品種。由此認(rèn)定，該菌棒上的4個(gè)接種孔應(yīng)為香菇931和9319間隔接種，發(fā)菌之后由于交界部位菌絲體互相不親和而產(chǎn)生拮抗，因此出現(xiàn)了3條拮抗線。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)表明，問題菌棒混雜了香菇931和9319兩個(gè)品種。對(duì)同批次菌棒的抽樣試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種情況，一種為同一菌棒接種同一個(gè)品種，結(jié)果表現(xiàn)為沒有拮抗線，另一種為同一菌棒四個(gè)接種孔接種了上述兩個(gè)品種，結(jié)果表現(xiàn)為菌絲交界處出現(xiàn)一到三條拮抗線，且部位不一。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，菇農(nóng)在開放式接種過程中普遍采用一人打穴兩人接種的協(xié)作模式，如果兩人所拿菌種為同一品種，則菌棒不表現(xiàn)拮抗，如果非同一品種，則視兩人接種速度以及交叉或順序接入種穴情況，菌棒培養(yǎng)后出現(xiàn)一到三條拮抗線。

一般來說，因錯(cuò)種引發(fā)的香菇生產(chǎn)問題不會(huì)導(dǎo)致毫無收益，一旦出現(xiàn)，應(yīng)根據(jù)菌棒表現(xiàn)進(jìn)行初步甄別篩選，技術(shù)人員加強(qiáng)后期栽培技術(shù)指導(dǎo)，依據(jù)不同品種的特性進(jìn)行分類出菇管理，盡量提高香菇產(chǎn)量和收益，將損失降到最低限度。

目前，麗水市部分香菇主栽品種名稱較為相似，如931、939和9319，808和868等，一不小心，菌種標(biāo)記就很容易混淆，建議育種單位在品種命名時(shí)予以區(qū)分；同時(shí)，菌種企業(yè)在菌種保藏和生產(chǎn)過程中做好標(biāo)記、分類存放，并開展菌種預(yù)檢送檢工作，在生產(chǎn)季節(jié)前對(duì)食用菌菌種質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)鑒別，以保證所用種源的質(zhì)量，盡量規(guī)避可控風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防菌種事故的發(fā)生，為食用菌產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供保障。

[1] NY/T 1845-2010 食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng). 中國農(nóng)業(yè)出版社：中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).

[2] NY/T 1730-2009 食用菌菌種真實(shí)性鑒定 ISSR法. 中國農(nóng)業(yè)出版社：中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).

[3] NY/T 1743-2009 食用菌菌種真實(shí)性鑒定 RAPD法. 中國農(nóng)業(yè)出版社：中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).

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2095-0934（2014）01-043-02