真菌作為生物醫(yī)學材料的應用
——以靈芝子實體SACCHACHITIN為例的研發(fā)過程

蘇慶華

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真菌作為生物醫(yī)學材料的應用——以靈芝子實體SACCHACHITIN為例的研發(fā)過程

蘇慶華

（臺北醫(yī)學大學微生物及免疫學科，臺北 110）

到目前為止，SACCHACHITIN為唯一將真菌應用為生物醫(yī)學材料的案例。靈芝殘渣是一種堅韌的纖維。過去，學者對真菌細胞壁的研究也發(fā)現真菌細胞壁主要的組成是多糖（Polysaccharide）和幾丁質（Chitin），以及一些類似黑色素（Melanin）的成分。幾丁質最早發(fā)現在甲殼類之外骨骼，蟹殼幾丁質在1992時已發(fā)展成為商品化的傷口敷料，對傷口愈合具有優(yōu)良促進功能。靈芝殘渣同樣含有幾丁質，其以熱堿（IN NaOH 90oC）去除殘余脂蛋白、核酸、脂肪再以過氧化氫漂白去除黑色素，再做成模膜，是一種濾紙狀多孔性白色薄膜。此一薄膜幾丁質的含量約在40%～50%，其余為以葡萄糖為主的多糖（50%～60%）的復合體，稱之為SACCHACHITIN。經過一連串的細胞試驗、動物試驗、人體試驗證實具有生物兼容性、生物降解性、并無過敏性及抗體反應；同時對急性及慢性皮膚創(chuàng)傷均具有極優(yōu)良的愈合促進作用。其作用機理在于吸附傷口中由人體免疫細胞所產生過量的金屬型基質蛋白水解脢（MMP），以及細菌所產生的蛋白水解脢，避免細菌感染，結束發(fā)炎反應，提早進入肉芽組織生長期。此作用也會保護生長因子（Growth factors, TGF, PDGF和VEGF）不受破壞而加速愈合。SACCHACHITIN的專利已進行技術轉移；目前產品以鐳射（激光）除斑手術的術后修復面膜，以及化妝品為商品訴求。

SACCHACHITIN；靈芝；生物醫(yī)學；多糖；幾丁質

真菌不僅可作為食物、藥品，也可以作為生物醫(yī)學材料應用。真菌對人類的幫助可謂功不可沒。到目前為止，至少已有一個成功的也是唯一的案例（SACCHACHITIN）將真菌應用為生物醫(yī)學材料。本文從構想、原料成分分析、原理假說證明、專利申請、產品開發(fā)、技術轉移，以及市場營銷等方面敘述此案例的整個過程，以期能對有趣于此之同儕后進有所幫助。

1 緣 起

1985年起，靈芝逐漸成為保健食品的寵兒，一方面靈芝在傳統(tǒng)中藥中已享有很好的聲譽；另一方面因臺灣氣候適宜，且在蕈類栽培方面累積了很豐富的經驗，在此一時間點大量商業(yè)栽培靈芝子實體已成為可能。此外一些有關靈芝生理活性的研究報告也在這段時間陸續(xù)出爐，其中包括：許多靈芝酸等三萜類新化學成分的發(fā)現，抗過敏、降血脂肪、肝障礙排除等三萜類功能的研究，降血糖、提升免疫的靈芝多糖的確定等。加上許多民間傳說及文學作品的渲染，靈芝很快成為大家可接受的保健食品。

因此，對保健食品制造者而言，提高產品中三萜類及多糖含量成為產品競爭力的重要指標，但是靈芝所含的此二類成分的總和經常不超過10％。所以在制造過程中萃取三萜類及多糖后再加以濃縮，再以少量靈芝做為賦形劑，可提升三萜類及多糖在產品中的百分比，大部分靈芝子實體就成為殘渣。這些靈芝殘渣常作為有機堆肥或土壤改良劑而無別的明顯用途。1990年我們開始思考為這些殘渣尋找更好的用途，其中最可行的莫過于生物醫(yī)學材料的開發(fā)。

2 生物醫(yī)學材料的初期開發(fā)

靈芝殘渣是一種堅韌、革質化、咖啡色的纖維，實際上就是構成靈芝子實體的菌絲細胞，在顯微鏡下這些細胞有很厚的細胞壁。過去，學者對真菌細胞壁的研究也發(fā)現真菌細胞壁主要組成是多糖（Polysac charide）和幾丁質（Chitin），以及一些類似黑色素（Melanin）的成分[1]。幾丁質最早發(fā)現于甲殼類的外骨骼，之后也在真菌細胞壁中發(fā)現同樣的構造成分。蟹殼幾丁質在1992時已發(fā)展成為商品化的傷口敷料，其中日本的產品叫做Beschitin，是由蟹殼幾丁質纖維編織而成不織布，對傷口愈合具有優(yōu)良的促進功能[2]。因此，同樣含有幾丁質的靈芝殘渣，是否也能發(fā)展出類似功能及外觀的產品就成為初期構思目標。

為此，我們檢視了如何由螃蟹殼純化幾丁質的程序，發(fā)現如果從靈芝殘渣來純化幾丁質過程會更簡單[3]。首先，因為靈芝沒有蟹殼中所含的高量的碳酸鈣，可以免除酸處理（經常適用1N HCl）；而以熱堿（1N NaOH 90oC）去除殘余脂蛋白、核酸、脂肪及漂白去除黑色素的程序則相同。另一個更有利的條件是，靈芝殘渣本身就是菌絲所構成并不需要繁復的手續(xù)做成幾丁質纖維，再由這些纖維織成不織布。根據上述過程我們很快就完成產品原型（Prototype）——濾紙狀多孔性白色薄膜[4]的制作。

除了靈芝具革質化、含幾丁質纖維的子實體之外，是否也有其他真菌可以利用作為相同用途？我們嘗試了其他一些食用及藥用真菌，發(fā)現只要是具有堅韌革質化子實體的真菌幾乎都可以拿來做這方面的利用，因為只有革質化的子實體才會含較高的幾丁質（40％～50％）；而一般像雙孢蘑菇、金針菇、香菇等可口柔嫩肉質子實體的幾丁質含量經常不超過1％。因為靈芝殘渣原料取得十分方便，所以理所當然成為研究的首選。另外，常用來做發(fā)酵食品糖化的根霉菌（），生長迅速，在液態(tài)黑暗培養(yǎng)環(huán)境下，只要5天時間就會在培養(yǎng)基上層形成海綿狀、具有厚度的菌絲體，也可以制成類似靈芝薄膜的構造。為避免根霉菌產生黑色囊孢（Sporangium），可利用培養(yǎng)基組成及低產孢菌株來克服[5]，本構想正在專利申請中。

3 名稱的由來

此多孔性薄膜是否具有發(fā)展性完全決定于其功能，因此先進行動物實驗以大鼠背部皮膚切除法制造兩個鏡像傷口，敷以薄膜，及其他包括紗布及Beschitin作為對照組。2～3星期內我們驚奇地發(fā)現敷以靈芝薄膜及BesChitin的傷口以相同的速度迅速復原，而紗布對照組則離復原還有很大的距離。這結果給我們很大的鼓舞，于是就立即進行糖類分析，測試靈芝薄膜的基本組成到底是什么，在分析幾個樣品后答案相當一致：幾丁質的含量約在40%～50％，其余為以葡萄糖為主的多糖。于是就給這一復合體命名為：SACCHACHITIN[6]，表示這是葡萄多糖與幾丁質的復合薄膜。SACCHACHITIN后來在不同動物上進行的多次測試結果都非常一致，也成為測試其他傷口敷料的對照組。

4 安全性

SACCHACHITIN對人類表皮細胞及天竺鼠纖維母細胞無毒性，甚至有誘導增生的趨勢[7]。對大鼠無過敏性也無抗體誘導性，殖入SACCHACHITIN于大鼠體內也不會造成發(fā)炎反應[8]，顯示SACCHACHITIN是由糖類購成的復合體，具有很好的生物兼容性。

5 傷口愈合機制

SACCHACHITIN在沒有干燥之前就像一般的紙漿，即使經過冷凍干燥后外表看起來就像一張很普通的濾紙，但是在傷口愈合的功效上卻有突出的表現，顯示多糖與幾丁質的組合在生物醫(yī)材的利用上具有特殊意義，這也啟發(fā)我們探討其作用機制。實際上，在一些教科書上已經可以看出一些端倪，就是真菌細胞壁的功能，除了賦予真菌細胞固定形狀、保護細胞免受干、冷、熱等物理條件變化的影響外，還有一個很重要的推論就是真菌細胞壁也會中和一些外來的分解性酵素，使這些具有破壞性的酶吸附在細胞壁上并失去活性，從而無法侵害到細胞內的組成。真菌細胞壁就是利用此特性，能在自然界極其復雜的微生物環(huán)境中脫穎而出。這些分解性酵素中，最為關鍵的應屬蛋白水解酶（Proteases）。

回到人或動物皮膚創(chuàng)傷來思考，傷口一旦形成，細菌很快會在傷口上迅速繁殖，并分泌蛋白水解酶將蛋白質分解成氨基酸，作為細菌生長的營養(yǎng)來源；蛋白水解酶也可能來自人體本身的防御系統(tǒng)，例如：嗜中性球或巨噬細胞所釋放的基質金屬型–蛋白酶（Matrix metallo-proteases，簡稱MMP）。如不立即處置，傷口就如同戰(zhàn)場一樣以各種武器求勝，一般健康的人傷口會有發(fā)炎期（Inflammation），待入侵的微生物清除后進入肉芽生長期（Granulation），最后進入重塑期（Remodeling），使傷口恢復到接近原有的狀況。一般從較小傷口（2×2 cm2）發(fā)生至復原需要3周至一個月。SACCHACHITIN可縮短這樣的急性創(chuàng)傷（Acute wound）復原時間至少一周，原因在于SACCHACHITIN可吸附并使無論是細菌或免疫細胞產生的蛋白酶失去功能，使發(fā)炎期立即終止，迅速進入肉芽期；同時SACCHACHITIN也對纖維母細胞及表皮細胞有促進移行（Migration）的生長作用，使傷口迅速愈合。以上假說有酵素實驗、細胞實驗、動物實驗來支持[8,9,10]。

以上所描述是針對急性創(chuàng)傷可能發(fā)生的狀況，而另外一種情形則是慢性創(chuàng)傷（Chronic wound）或叫做愈合困難創(chuàng)傷、不愈合傷口等。慢性創(chuàng)傷當然是由急性創(chuàng)傷發(fā)展出來的，常發(fā)生在糖尿病、長期服用類固醇、感染抗藥性細菌及長期臥床的病人身上。這類傷口的共同點就是在6個月內無法愈合，以抗生素處理或其他藥劑無法治愈，并且在傷口組織或滲出液中含有大量過度分泌的基質金屬型–蛋白酶（MMP），尤其是MMP–2及MMP–9（都是膠原蛋白分解酶）。也就是急性創(chuàng)傷發(fā)生后，細菌與免疫細胞的戰(zhàn)爭持續(xù)，發(fā)炎反應無法結束，SACCHACHITIN這時也就發(fā)揮抑制這些酵素的作用，在2001年進行的50例人體實驗中，36人在2～3周內傷口達到完全愈合（14人沒有回診）；同時在這些病人傷口滲出液中，也檢視到SACCHACHITIN處理后MMP–2及MMP–9顯著減少[10]。此外，對5個褥瘡病人亦有類似效用。

6 對抑制痤瘡(青春痘)的延伸應用

痤瘡主要因為皮膚毛囊中的皮脂腺不正常分泌過多脂肪，造成毛孔阻塞形成無氧環(huán)境，提供喜歡分解脂肪及厭氧的痤瘡丙酸菌（）生長所需的良好環(huán)境，進而造成發(fā)炎，青少年乃至成人都可能發(fā)生。誠如上述SACCHACHITIN抑制蛋白水解酶機制，是否也有可能抑制痤瘡丙酸菌所分泌的脂酶（Lipase）？因為脂酶將脂肪（Lipid）分解成脂肪酸（Fatty acids）及甘油（Glycerol），痤瘡丙酸菌才能進一步利用其作為熱量來源并以繁衍。因此，抑制脂酶就可抑制痤瘡丙酸菌生長并達到抑制治療青春痘的目的。在體外試驗，SACCHACHITIN明顯抑制脂酶及痤瘡丙酸菌的生長(11)，非正式人體測試結果也令人滿意。這也顯示SACCHACHITIN除了可能作為皮膚瘡傷愈合的生物醫(yī)學材料外，也在化妝品或醫(yī)學美容材料中扮演一些角色。

7 劑型開發(fā)

SACCHACHITIN最早為冷凍干燥的多孔性薄膜，后為能更方便涂布于傷口上而發(fā)展成軟膏。經過微米化處理則可成為粒徑2.0 μm的半透明懸浮液（1％～5％，w/v），作為已證實能修復角膜損傷的眼藥水[12]。

8 SWOT分析

SACCHACHITIN發(fā)展至今將近20年，其安全性、功效及機制也逐漸清楚。其SWOT分析如下。

優(yōu)勢：（1）原料來自當地栽培靈芝殘渣，原料便宜且供應充足。（2）制程相較于蟹殼幾丁質醫(yī)學材料更為簡單。（3）相較以蛋白質為主體的生物醫(yī)材，無菌處理簡單，可用高壓高溫滅菌而不需輻射處理。（4）具有良好的生物兼容性、生物降解性、安全性及清楚的機制。（5）效果優(yōu)異。

劣勢：（1）雖然已完成各階段測試，生產者仍需投入可觀的資金于GLP實驗室完成符合可用于人體的各項文件。（2）已開發(fā)販賣類似產品的廠商不愿意投入以免影響原有產品的投資及市場。

機會：（1）面對全世界逐年以5.3％增加，預測2016年總金額將達393億美元的創(chuàng)傷敷材市場[13]， SACCHACHITIN有機會在其中占一席之地。（2）中國大陸市場為該市場增加最為迅速的區(qū)塊，極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

威脅：由蟹殼所生產的幾丁質及幾丁聚糖（Chitosan），已占有創(chuàng)傷敷材的市場先機，如何突破需在營銷技巧上費更多心思。

9 專利、技術轉移及營銷

SACCHACHITIN在臺灣已取得15年專利，并已技術轉移給藥廠，產品有面膜、軟膏及凝膠，主要用于鐳射除斑術后的皮膚迅速修復，主要市場為中國大陸。

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[2] http://www.unitika.co.jp/medical/e/products/beschitin/index.html.

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[13] http://www.giiresearch.com/report/fd243605-world-wound-management-products.html . Abstract for world wound management products to 2016 - Industry market research, market share, market size, sales, demand forecast, market leaders, company profiles, industry trends.

Application of Mushrooms on Biomedical Materials—R&D Process of SACCHACHITIN

Ching-Hua Su

(Department of Microbiology and Immunology, Taipei Medical University, Taipei 110)

In traditional way, the application of mushrooms can be used as food or drugs, however, in present study, the cell wall part of mushroom is also applied to biomedical materials. SACCHACHITIN is a trade name for this purpose and it is the only one case that successfully developed for wound healing enhancement and cosmetic products. The present report described the process of initiation of the idea, analysis of cell wall content, collection of evidences for the hypothesis, application of pattern and finally the transfer of the techniques for commercial application. Since 1992, chitin product from crab shell for wound healing had widely used in medication for the treatment of skin trauma. It is also known that the cell wall of fungi containing mainly polysaccharide with different percentage of chitin in mushrooms and in our case, we used fruiting body ofthat the chitin content is over 40% in weight and was considered as a suitable material for the use as a wound dressing, especially when large quantities of residual waste of fruiting bodies was left behind useless from the offunctional food factory accompanied by the extraction processing. The waste residue offruiting bodies was treated with sodium hydroxide (1N, 90oC 2hr) to remove residual protein, nucleic acid and fat and the following beaching process by hydrogen peroxide for de-pigmentation to obtain pulp-like fiber. The prototype of SACCHACHITIN was then formed through membrane manufacturer. The name of SACCHACHITIN was from the combination of polysaccharide and chitin because it containing almost equal part of both component. The bio-compatibility, bio-degradability, allergic and antigenic reaction of SACCHACHITIN was evaluated by models of cell culture, animal test as well as human trials to prove the safety. Excellent property in enhancement of wound healing was also demonstrated by SACCHACHITIN for its high binding ability with PPMs from macrophages and proteases produced by bacteria. This ability resulted in early termination of inflammation of the wound and accelerated the process of wound healing with more growth factors (TGF, PDGF and VEGF) retained active by the protection of SACCHACHITIN from the digest of proteases. The similar activity was discussed for the proteases deprivation from the bacteria that also prevent extensive growth of bacteria in the wound area. he pattern of SACCHACHITIN transfer for commercial use and products of cosmetics and face membrane for repairing of wound of lacer de-pigmentation surgery are available in market.

SACCHACHITIN；；biomedical；Polysaccharide；Chitin

R318.08

A

2095-0934（2014）01-009-05