藥用植物人參內(nèi)生菌研究*

張雷鳴，任偉超，劉秀波，張艷賀，孔祥軍，佟春香，馬 偉△

1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；3齊齊哈爾中醫(yī)醫(yī)院

動 態(tài)·研究進(jìn)展

藥用植物人參內(nèi)生菌研究*

張雷鳴1，任偉超1，劉秀波1，張艷賀1，孔祥軍2，佟春香3，馬 偉1△

1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；3齊齊哈爾中醫(yī)醫(yī)院

對藥用植物內(nèi)生菌的研究進(jìn)行概述，指出人參內(nèi)生菌的多樣性、普遍性，并對人參內(nèi)生菌的分離、次級代謝產(chǎn)物的鑒定檢驗、內(nèi)生菌的抑菌能力以及生物防治進(jìn)行類比分析，發(fā)現(xiàn)人參內(nèi)生菌研究過程中存在的問題以及其主要的研究方向，同時指出未來研究發(fā)展的前景。

人參；內(nèi)生菌；研究技術(shù)；應(yīng)用進(jìn)展

內(nèi)生菌（e n d o p h y t e）是一個龐大的具有普遍存在性的微生物特殊類群，他們的部分或全部生活史存在于健康的植物組織內(nèi)部，分布廣泛、種類多樣，同時不引起宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀。目前研究的藥用植物內(nèi)生菌主要包括藥內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌以及內(nèi)生放線菌。其中研究藥用植株中對放線菌的研究與關(guān)注相對另外兩種少一些。苔鮮植物、蕨類植物、裸子植物和被子植物中都發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生真菌［1］。杜慧竟等［2］采用1 0種分離培養(yǎng)基對3 7個新鮮的藥用植物樣品進(jìn)行內(nèi)生放線菌的分離，分離得到9 4 0株植物內(nèi)生菌，分屬于4 7個屬，3 0個科，其中放線菌6 0 0余株，分屬于3 4個屬，潛在的新分類單元有7個。內(nèi)生菌在宿主的科、種以及組織水平上存在專一性。這種專一性可能是內(nèi)生菌與宿主在長期共同進(jìn)化中形成的，黃璐琦等［3］闡述產(chǎn)生這種專一性的可能原因是不同植物內(nèi)生菌可利用不同的基質(zhì)，對生活環(huán)境有不同的要求，因而內(nèi)生菌具有不同的生活方式。郝榮喬［4］在《微生物通報》中評述“植物內(nèi)生菌已成為我國微生物研究領(lǐng)域的熱點”。目前對內(nèi)生菌的研究以及應(yīng)用主要集中在農(nóng)學(xué)和藥學(xué)兩大學(xué)科領(lǐng)域：農(nóng)學(xué)研究的目的主要是發(fā)掘和利用內(nèi)生菌對植株有利的生物學(xué)作用，提高植物的生長、生產(chǎn)、抗病蟲害的能力等，在保證環(huán)境優(yōu)化的同時提高作物產(chǎn)量。植物內(nèi)生菌現(xiàn)已知的生物學(xué)作用主要包括促進(jìn)植物生長、生物固氮作用、增強宿主植物抗病蟲害、抗逆境等作用。藥學(xué)領(lǐng)域的研究針對藥用植物而言，主要目的有3個，一是與農(nóng)學(xué)研究的目的一致，利用生物學(xué)作用提高藥材的產(chǎn)量與品質(zhì)，尤其是名貴藥材；二是發(fā)現(xiàn)在適宜條件下產(chǎn)生或促進(jìn)藥用植物產(chǎn)生宿主藥材的有效藥用成分的內(nèi)生菌；三是發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生新的有效活性成分的內(nèi)生菌。本研究針對藥用植物中的名貴藥材人參近年來的研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 人參內(nèi)生菌的研究現(xiàn)狀

人參（Panax ginseng C.A.M e y）為五加科名貴中藥材，中國、韓國、朝鮮均出產(chǎn)，我國主產(chǎn)地在東北地區(qū)，多長于山地緩坡或斜坡地的針闊混交林或雜木林中［5］，其中以吉林省人參最負(fù)盛名。人參的化學(xué)成分包括人參皂苷、維生素、多糖、氨基酸、甾醇、揮發(fā)油以及多種微量元素等?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷是其主要活性成分，已從紅參、生曬參或白參中共分離出3 0余種人參皂甙，可分為3組即齊墩果酸組、原人參二醇組和原人參三醇組，具有提高組織抗福射、抗衰老、抗腫瘤、抗缺氧能力、改善微循環(huán)等藥理學(xué)作用。人參的名貴以及內(nèi)生菌群的特殊性使得人們開始關(guān)注人參內(nèi)生菌的研究，閱讀文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前人參內(nèi)生菌的研究主要是對內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌的研究，與人參內(nèi)生放線菌相關(guān)的文獻(xiàn)資料未見報道。

1.1 人參內(nèi)生菌的分離及多樣性 目前內(nèi)生菌的分離方法主要是組織塊分離法和組織勻漿法，由于內(nèi)生菌存在的普遍性和廣泛性以及宿主專一性，所選擇的人參產(chǎn)地以及分離部位多種多樣。姜云等［6］采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法從吉林省5個不同地區(qū)來源的健康人參植株的根、莖、葉中分離獲得了人參內(nèi)生菌，內(nèi)生細(xì)菌1 5 2株，內(nèi)生真菌4 6株，但并未對其進(jìn)行系統(tǒng)鑒別，其中人參內(nèi)生細(xì)菌采用研磨法分離，內(nèi)生真菌采用組織塊法分離。徐麗莉［7］在其碩士論文中以5年生園參和1 5年生移山參為研究對象，進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離，共分離純化得到內(nèi)生真菌4 8株，其中園參內(nèi)生真菌2 7株，移山參內(nèi)生真菌2 1株；并通過形態(tài)及分子生物學(xué)方法鑒定了其中4 0株，鑒定得到1 4個分類單元，將其歸屬到8科1 0屬1 2種。內(nèi)生菌的生長需要不同的基質(zhì)，因此選擇不同的培養(yǎng)基會培養(yǎng)出不同種類的內(nèi)生菌，采用多培養(yǎng)基同時培養(yǎng)可以分離的菌種種類數(shù)量得到提高，使得分離的全面性得到改善，其中李勇等［8］利用3種不同細(xì)菌培養(yǎng)基對人參根部細(xì)菌進(jìn)行提取分離，共分離4 0種內(nèi)生細(xì)菌，L B培養(yǎng)基1 0株，N A培養(yǎng)基2株，Y D C培養(yǎng)基2 8株。

1.2 人參內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物的研究 次生代謝產(chǎn)物對植物而言是植物對環(huán)境的一種適應(yīng)，它對植物之間的相互競爭和協(xié)同進(jìn)化，以及對抗逆境抗病蟲害等過程起重要作用［9］。研究流程均為將人參內(nèi)生菌置于適宜的液體培養(yǎng)基中，根據(jù)不同菌株，優(yōu)化選擇發(fā)酵時間，然后對其發(fā)酵液進(jìn)行化學(xué)檢驗或確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)僅見對內(nèi)生真菌發(fā)酵液的產(chǎn)物檢驗及化學(xué)成分結(jié)構(gòu)研究，針對內(nèi)生細(xì)菌的研究鮮有。孫月［10］對人參次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分的研究僅限于對菌株R P的活性成分進(jìn)行初步的研究。采用大孔樹脂柱的方法找到抑菌活性物質(zhì)的存在部位。在8 0%～9 0%乙醇溶液收集到的洗脫液中發(fā)現(xiàn)大部分的活性物質(zhì)，檢測到有皂甙類成分存在，利用T L C方法對其化學(xué)成分進(jìn)行初步鑒定，與人參皂苷比移值相近，表明在發(fā)酵液中可能含有人參皂苷R e。徐麗莉［7］通過人參內(nèi)生菌體外抗腫瘤實驗選取活性較高的Y u a n-2 5菌株，對其發(fā)酵產(chǎn)物的乙醚部位進(jìn)行G C-M S檢測，鑒定出3 8種成分，主要成分為I n d a n e-1，3-d i o n e，2-（3，4-d i m e t h o x y-b e n z y l i d e n o）-（4 0.0 1%），A nd r o s t-2-e n-4-o n e，1 7-（t e t r a-h y d r o p y r a n-3-y l）o x y（7.7 6%），蒼耳素（x a n t h a t i n，4.4 1%），異丹參酮Ⅱ（i s o t a n s h i n o n eⅡ，3.0 3%）。張薇［11］從人參根部分離得到2株對人參皂苷R b 1具有專一轉(zhuǎn)化活性的內(nèi)生菌莫勒接霉（Z y g o r h y n c h u s m o e l l e r i）和灰綠犁頭霉（A b s i d i ag l a u c a），其能夠?qū)⒃碥誖 b 1轉(zhuǎn)化為人參皂苷R d。

1.3 人參內(nèi)生菌的抑菌作用以及生物防治 人參內(nèi)生菌抑菌實驗常利用培養(yǎng)基平板對峙培養(yǎng)法和抑菌圈法，初步篩選出對病原菌有抑制效果的菌株，而后再對該菌株進(jìn)行進(jìn)一步實驗研究，比如抗病性以及生物防治。生物防治是指除人以外的一種或多種生物降低病原物數(shù)量或減弱病原的致病活力，從而減少病原物所致病害的發(fā)生［12］，微生物屬其中一種。姜云等［13］篩選出菌株N J 1 3，該菌株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B a c i l l u sm e t h y l ot r o p h i c u s），該菌對人參7種主要病害病原菌和1 7種其他植物病害病原菌均具有一定的拮抗作用，菌株的發(fā)酵液對人參立枯菌（R h i z o e t o n i a s o l a n i）的抑菌效果最強。邱服斌等［14］從人參根部獲得一株內(nèi)生細(xì)菌g e 2 1，對其進(jìn)行抑菌試驗，結(jié)果表明該菌株對尖孢鐮刀菌（F u s a r i u mo x y s po r i u m）、寄生疫霉菌（P h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c a）、劍麻炭疽病菌（C o l l e t o t r i c h u ma g a v e s）、煙草赤星病菌（A l t e r n a r i al o n g i p e s）、稻瘟病菌（P y r i c u l a r i a o r y z a e）、人參立枯病菌（R h i z o c t o n i a s o l a n i）、人參疫病菌（P h y t o p h t h o r ac a c t o r u m）和人參菌核病菌（S c l e r o t i n i as c h i n s e n g）均有一定的抑菌活性。然而對理想的生物防治因子而言，既要能產(chǎn)生有效的拮抗因子抑制病原菌，又要在植株體內(nèi)有很好的定殖能力［15］。人參內(nèi)生菌的研究只停留在對抑菌作用的菌株的篩選方面，以其確定合適的生防菌株，并未涉及在人參植株體內(nèi)的定殖。劉時輪等［16-18］針對綠色木霉菌T v 0 4-2對人參立枯病菌的一系列研究為人參內(nèi)生菌的生物防治的研究提供了一定的思路。

2 人參內(nèi)生菌研究展望

內(nèi)生菌的多樣性以及宿主的專一性決定了不可能將一株植物的內(nèi)生菌全部分離出來，而且消毒時間的長短均對內(nèi)生菌的多樣性產(chǎn)生一定的影響，可采用多個培養(yǎng)基，多種培養(yǎng)條件同時培養(yǎng)，以期分離得到更多的菌株，但工作量巨大。因此需要發(fā)現(xiàn)新的分離方法在保證分離數(shù)量質(zhì)量的同時減少工作量。從人參內(nèi)生菌分離的數(shù)量看，其內(nèi)生資源較為豐富，但已被研究者關(guān)注并研究的菌株比例僅占3%～5%左右，未被開發(fā)的內(nèi)生菌資源還很大，因此對人參內(nèi)生菌的研究需要參考微生物學(xué)領(lǐng)域的研究，運用多種現(xiàn)代研究技術(shù)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌與人參之間的作用關(guān)系、抗病機理以及次生代謝的功能性基因，深層次挖掘，不能僅停留于分離、發(fā)酵、抑菌實驗流程的表層，為人參內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定一定的理論基礎(chǔ)。人參內(nèi)生菌生物防治的開發(fā)有一定的實際意義，但距離真正的生物農(nóng)藥的開發(fā)以及廣泛使用還有一定的距離，其中需要考慮的因素諸多，比如對土壤的污染，人參生長環(huán)境的菌群失調(diào)等。人參的名貴讓內(nèi)生菌開發(fā)沿著成本低、高成效的路線開展，隨著人參內(nèi)生菌研究的逐步深入，其應(yīng)用領(lǐng)域定會越來越廣泛，為人類生活帶來更大的益處。

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Research on Endophytes of Medicinal Plant Ginseng

ZHANG Leiming1，REN Weichao1，LIU Xiubo1，ZHANG Yanhe1，KONG Xiangjun2，TONG Chunxiang3，MA Wei1△
1 College of Pharmacy of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2 The First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College；3 Qiqihar Municipal TCM Hospital

We reviewed the studies on endophytes of medicinal plant，and pointed out that the diversity and universality of endophytes of ginseng，we found the issues existed in the study of ginseng endophytes，main directions of the studies and the prospect of further studies by comparing and analyzing the separation of ginseng endophytes，identification of secondary metabolite，antibacterial ability and biological control.

ginseng；endophytes；research techniques；application progress

R22

A

1004-6852（2014）05-0129-03

2013-12-11

農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項（編號201303111-04），黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃”

張雷鳴（1988—），女，碩士研究生。研究方向：生藥學(xué)。

△通訊作者：馬偉（1969—），女，博士研究生導(dǎo)師，博士學(xué)位，研究員。研究方向：藥用植物生物工程。