硫化氫通過(guò)PI3K／AKT-NF-κB通路調(diào)節(jié)重癥急性胰腺炎

饒春燕，胡昌倫，付蘭英，趙曉晏△

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶400037；2.武警重慶總隊(duì)醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶400061；3.重慶市中醫(yī)院脾胃科400021）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是伴隨著胰周或全身性炎癥，并可發(fā)展為多器官功能障礙綜合征（multiorgan dysfunction syndrome，MODS）的胰腺炎癥過(guò)程，病死率高達(dá)20%～60%［1］。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，胰酶、氧化損傷、炎癥介質(zhì)等均參與其中。目前認(rèn)為SAP 發(fā)生時(shí)各種促炎細(xì)胞因子是導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammation response syndrome，SIRS）發(fā)生的關(guān)鍵因素，而SIRS 是造成MODS 的重要原因。如何才能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和相互作用，阻斷SIRS 和MODS 的發(fā)生，對(duì)于防止急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）發(fā)展為SAP 具有重要的意義。

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）被認(rèn)為是繼CO、NO后的第3 種新型氣體分子，H2S 主要以L-半胱氨酸為底物通過(guò)激活5′-磷酸吡哆醛依賴性酶：胱硫醚-γ裂解酶（cystathionineγlyase，CSE，EC 4.4.1.1）和胱硫醚-β合成酶（cystathionineβsynthase，CBS，EC 4.2.1.22）而生成［2］；同時(shí)，還可以以α酮戊二酸為底物通過(guò)3-巰基丙酮酸鹽硫轉(zhuǎn)移酶（3-Mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MTS）而產(chǎn)生［3］。H2S 在體內(nèi)可能有2種存在形式：1／3以氣體H2S 形式存 在，2／3以Na HS（HS-）形式存在。大多數(shù)CBS 存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，而外周組織中CSE 活性較高。已有大量研究證實(shí)H2S 調(diào)節(jié)血管、胃腸道、心肌收縮，神經(jīng)傳遞和胰島素分泌［4-5］等方面起著重要的作用。近年來(lái)，學(xué)者們也開始通過(guò)多種不同的炎癥模型來(lái)研究H2S在炎癥過(guò)程中的意義，但結(jié)果不一。

1 材料與方法

1.1 材料 96 只6 周齡SPF 級(jí)SD雄性大鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量202～243 g。左旋精氨酸（中國(guó)上海生物有限公司），wortmannin（以下簡(jiǎn)寫W）、考馬斯亮藍(lán)G-250、溴酚藍(lán)（美國(guó)Sigma 公司），髓過(guò)氧化物酶測(cè)試盒（中國(guó)南京建成生物有限公司），IL-6 ELISA試劑盒（美國(guó)R＆D公司），兔抗大鼠p-AKT單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國(guó)Santa 公司），兔抗大鼠IκBα單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（英國(guó)Abcam公司），小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體、辣根標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為美國(guó)Pr oMab 公司產(chǎn)品，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、EMSA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Pierce 公司），甲基磺酰氟（PMSF）（美國(guó)Sigma 公司），核蛋白提取試劑盒（中國(guó)南京凱基生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型構(gòu)建及分組 構(gòu)建模型前用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)SD大鼠5 d，術(shù)前12 h禁食不禁水。大鼠分為對(duì)照組（n＝6）、SAP組（n＝10）、PAG＋SAP組（n＝10）、5 mg／kg Na HS＋SAP 組（n＝10）、10 mg／kg Na HS＋SAP組（n＝10）、20 mg／kg Na HS＋SAP組（n＝10）、100 mg／kg Na HS＋SAP組（n＝10）、W＋SAP組（n＝10）、5 mg／kg Na HS＋W＋SAP組（n＝10）和100 mg／kg Na HS＋W＋SAP組（n＝10）。參照賴銘裕等［6］的方法建立SAP 模型。SAP 組及干預(yù)組均采用經(jīng)腹腔注射6%左旋精氨酸溶液誘導(dǎo)模型；PAG組建模前1 h 經(jīng)腹腔注射PAG 50 mg／kg；各Na HS 組建模前1h 經(jīng)腹腔分別注射Na HS 5、10、20、100 mg／kg［7］；各 組 注 射 左 旋 精 氨 酸 前0.5 h 大鼠腹腔注射1.4 mg／kg［8］。對(duì)照組以生理鹽水代替左旋精氨酸。各組大鼠注射后禁食，自由飲水。

1.2.2 標(biāo)本采集及處理 建模24 h 后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，抽右心血離心后檢測(cè)IL-6；鈍性分離胰腺后立即凍存于液氮內(nèi)，以備胰腺髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidas，MPO）活性、胰腺磷酸化絲／蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）、核因子抑制蛋白-κB（IκBα）表達(dá)水平和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）活性檢測(cè)。

1.2.3 ELISA法測(cè)定血漿I L-6按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血漿IL-6 水平。

1.2.4 胰腺組織M P O活性檢測(cè) 將液氮凍存胰腺組織剪成小塊，稱質(zhì)量，加入9倍質(zhì)量的生理鹽水于Dounce 勻漿機(jī)勻漿，制成10%胰腺組織勻漿，按照MPO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)MPO活性。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè)胰腺組織p-AKT、IκBα表達(dá)水平 胰腺組織加入RIPA緩沖液和PMSF后組織勻漿，12000 r／min 離心10 min，取上清液，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白量。每孔加樣20μg 蛋白，加入等量上樣緩沖液，混勻，煮沸3 min 使蛋白變性，上樣于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電泳完畢后，電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，并用新鮮配制的含3% 脫脂奶粉的PBS 液封閉過(guò)夜，然后加入p-AKT單克隆抗體（1∶300），IκBα單克隆抗體（1∶500）及抗GAPDH抗體（1∶8000），4℃過(guò)夜。將膜取出后用PBS 沖洗3 次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像儀掃描圖像。

1.2.6 EMSA法檢測(cè)胰腺組織NF-κB 活性 按核蛋白 提 取試劑盒說(shuō)明書提取胰腺核蛋白。采用生物素3′末端標(biāo)記法將選取核苷酸序列為5′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-3′，3′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-5′（湖南遠(yuǎn)泰生物有限公司合成）。將8μg 核蛋白與20 fm生物素標(biāo)記的探針充分結(jié)合，上樣于5%PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至帶正電荷的尼龍膜上，紫外線交聯(lián)15 min，封閉15 min 后與結(jié)合液孵育，用化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像儀掃描圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行單因素方差分析和LSD-q 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血漿IL-6 水平 SAP 組和PAG＋SAP 組血漿IL-6 水平較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），且PAG＋SAP組高于SAP 組（P＜0.05）；不同劑量NaHS＋SAP組血漿IL-6 水平隨著Na HS 濃度升高逐漸降低，其中5 mg／kg Na HS＋SAP組與SAP 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），10 mg／kg Na HS＋SAP、20 mg／kg Na HS＋SAP、100 mg／kg Na HS＋SAP 組均低于SAP 組（P＜0.05），但仍高于對(duì)照組（P＜0.05）；給予W后，W＋SAP 組較SAP組大鼠血漿I L-6水平明顯降低（P＜0.05）；5 mg／kg Na HS＋W＋SAP 組與5 mg／kg Na HS＋SAP組相比，血漿IL-6 水平明顯降低（P＜0.05），100 mg／kg Na HS＋W＋SAP 組較100mg／kg NaHS＋SAP 組血漿IL-6 水平也有明顯下降（P＜0.05），見圖1A、表1。

2.2 各組大鼠胰腺M(fèi)PO活性 S A P組和P AG＋S A P組胰腺M(fèi)PO活性較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），且PAG＋SAP 組高于SAP 組（P＜0.05）；不同劑量NaHS 組胰腺M(fèi)PO活性隨著Na HS 濃度升高逐漸降低，其中5mg／kg NaHS＋SAP 組與SAP 組差異 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＞0.05），10 mg／kg Na HS＋SAP、20 mg／kg Na HS＋SAP、100 mg／kg Na HS＋SAP 組均低于ANP 組（P＜0.05），但仍高于對(duì)照組（P＜0.05）；與SAP 組比較，W＋SAP 組大鼠胰腺M(fèi)PO活性明顯降低（P＜0.05）；與5 mg／kg Na HS＋SAP 組和100 mg／kg Na HS＋SAP組比較，給予W后胰腺M(fèi)PO活性均有明顯降低（P＜0.05），見圖1A，表1。

2.3 大鼠胰腺p-AKT蛋白表達(dá) 與對(duì)照組（55.741±0.786）比較，SAP 組（154.230±1.719）和PAG＋SAP組（181.950±2.372）p-AKT表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05），且后者較前者更高（P＜0.05）；給予不同劑量Na HS 后，p-AKT表達(dá)逐漸減弱強(qiáng)，且各組均低于對(duì)照組（P＜0.05），高于SAP組（P＜0.05）；給予W后，W＋SAP組（121.543±1.198）、5 mg／kg Na HS＋W＋SAP 組（94.587±0.921）及100mg／kg NaHS＋W＋SAP 組（60.149±0.812）分別與SAP組（154.230±1.719）、5 mg／kg Na HS ＋SAP組（129.710±1.241）和100 mg／kg Na HS ＋SAP 組（67.149±0.767）比較，p-AKT蛋白表達(dá)均有明顯減弱（P＜0.05），見圖2A。

圖1 各組大鼠血漿IL-6 水平和MPO活性分析圖

表1 各組大鼠血漿IL-6 水平、胰腺M(fèi)PO活性（±s）

表1 各組大鼠血漿IL-6 水平、胰腺M(fèi)PO活性（±s）

組別 IL-6（ng／L） 胰腺M(fèi)PO（U／L）12.45±0.600.28±0.02 SAP 組 176.76±9.301.78±0.07 PAG＋SAP 組 212.66±10.202.10±0.125 mg／kg Na HS＋SAP 組 166.16±9.501.70±0.0810 mg／kg Na HS＋SAP 組 145.72±8.701.58±0.0920 mg／kg Na HS＋SAP 組 103.32±6.901.36±0.08100 mg／kg Na HS＋SAP 組 145.72±8.701.58±0.09 W＋SAP 組 141.36±6.91.41±0.075 mg／kg Na HS＋W＋SAP 組 130.88±4.201.32±0.05100 mg／kg Na HS＋W＋SAP 組對(duì)照組75.10±2.801.11±0.03

2.4 各組大鼠胰腺IκBα蛋白表達(dá)與對(duì)照組（195.350±2.320）比較，SAP組（90.671±1.217）和PAG＋SAP組（63.065±0.679）IκBα表達(dá)明顯減弱（P＜0.05），且后者較前者更低（P＜0.05）；給予不同劑量Na HS 后，IκBα表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且各組均低于對(duì)照組（P＜0.05），高于SAP 組（P＜0.05）；給予W后，W＋SAP組（115.900±1.314）、5 mg／kg Na HS＋W＋SAP 組（158.710±1.697）及100 mg／kg Na HS＋W＋SAP組（174.950±1.879）分 別 與SAP組（90.671±1.217）、5 mg／kg Na HS＋SAP組（146.000±1.676）和100 mg／kg Na HS＋SAP 組（161.460±1.743）相比，IκBα蛋白表達(dá)均有明顯減弱（P＜0.05），見圖2B。

圖2 各組大鼠胰腺p-AKT、IκBα蛋白表達(dá)及灰度比、NF-κB 活性

2.5 各組大鼠胰 腺NF-κB活性 與 對(duì)照組相比，SAP組 和PAG＋SAP 組NF-κB 活性明顯增強(qiáng)，給予NaHS 后，NF-κB 活性逐漸減弱；給予W后，W＋SAP組、5 mg／kg Na HS＋W＋SAP 組及100 mg／kg Na HS＋W＋SAP組 分別與SAP組、5 mg／kg Na HS＋SAP組 和100 mg／kg NaHS＋SAP組 比 較，NF-κB 活性均有不同程度減弱，圖2C。

3 討 論

近來(lái)有研究顯示，H2S 通過(guò)介導(dǎo)AKT激活從而提高心動(dòng)指數(shù)和減少心肌梗死面積，同時(shí)使用LY294002 抑制AKT則會(huì)消除H2S 產(chǎn)生的這種心臟保護(hù)作用［9］。Ramasamy 等［10］也認(rèn)為H2S 在雨蛙肽處理的胰腺腺泡細(xì)胞中通過(guò)PI3K／AKT通路起著抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生，并且該作用不會(huì)引起p38、Jun、MAPK 磷酸化。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，認(rèn)為H2S可以通過(guò)PI3K／AKT 通路在炎性反應(yīng)中起到抑制作用。

NF-κB 是一種廣泛存在與細(xì)胞中易被誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子，它是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)和凋亡等信號(hào)通路的關(guān)鍵 細(xì) 胞 因 子［11］。PI3K／AKT是調(diào)節(jié)NF-κB及 下 游 依賴基因表達(dá)的重要介質(zhì)，而大量研究證實(shí)AP的發(fā)生、發(fā)展有賴于NF-κB 轉(zhuǎn)錄，它在調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)及基因表達(dá)中起著重要作用［12-13］。更有研究證實(shí)，人單核細(xì)胞中，NF-κB 轉(zhuǎn)錄是外源性H2S 導(dǎo)致細(xì)胞因子表達(dá)的核心部分［14］。本研究發(fā)現(xiàn)H2S在SAP 大鼠模型中的調(diào)節(jié)作用與抑制IκBα降解，并下調(diào)NFκB 及轉(zhuǎn)錄相關(guān)的促炎基因表達(dá)有關(guān)；并且，給予PI3K抑制劑W后，NF-κB 進(jìn)一步下降，血漿IL-6 水平及胰腺M(fèi)PO活性也明顯降低。TNF-α處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞［15］、LPS 處理的星狀細(xì)胞［16］等體外細(xì)胞培養(yǎng)中，Na HS 可以通過(guò)抑制IκBα降解和NF-κB 核轉(zhuǎn)位而產(chǎn)生保護(hù)性作用。在靜脈注射Na HS 能夠抑制NO和超氧化物的產(chǎn)生，從而在失血性休克復(fù)蘇再灌注早期時(shí)維持平均動(dòng)脈壓，下調(diào)NF-κB 活性劑iNOS 和ICAM-1水平［17］。

AKT是PI 3K調(diào)節(jié)的主要效應(yīng)因子，它的激活有賴于依賴磷酸肌醇的激酶（PDK-1）使Thr308和Ser473發(fā)生磷酸化［17］。一但AKT被激活，即可產(chǎn)生廣泛的作用調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和生長(zhǎng)［17］。雖然AKT不是由PI 3K直接激活磷酸化的，但是其下游調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是嚴(yán)格按照PI3K的活性來(lái)調(diào)節(jié)的。H2S 能使培養(yǎng)的內(nèi)皮 細(xì)胞［18］、結(jié)腸 癌 細(xì) 胞［19］、雨 蛙 肽處理的胰腺腺泡細(xì)胞［10］及大鼠下肢缺血肌肉［20］中的AKT活化，并且在局部缺血心肌組織中給予少量Na HS即可引起AKT活化，從而減輕心肌損傷［21］。本實(shí)驗(yàn)也認(rèn)為外源性H2S（Na HS）能夠通過(guò)AKT作用于炎癥因子，但不同的是，本實(shí)驗(yàn)中H2S 是通過(guò)抑制AKT磷酸化，從而下調(diào)炎癥因子的表達(dá)。之前的研究認(rèn)為激活PI3K／AKT通路能產(chǎn)生抗炎作用，這正與作者的觀點(diǎn)一致［22-23］。在本實(shí)驗(yàn)先給予外源性H2S，0.5 h后再給予W，二者起到了加強(qiáng)的作用，說(shuō)明H2S可能是通過(guò)PI3K下游的某因子來(lái)調(diào)節(jié)AKT活性的，但是其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

迄今為止，不少學(xué)者通過(guò)局部水腫、胰腺炎、敗血癥等多種動(dòng)物模型和細(xì)胞培養(yǎng)研究認(rèn)為H2S 在體內(nèi)具有促炎作用。外源性H2S（Na HS 或Na2S）能使血漿、組織中炎癥因子和趨化因子表達(dá)增加，而給予PAG后能逆轉(zhuǎn)H2S 的促炎作用［24-28］。H2S 的促炎作用可以通過(guò)pSFKs-NF-κB［26］及ERK-NF-κB通路［29］調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。在動(dòng)物模型中，Na HS作用于IFN-γ處理的人單核細(xì)胞系U937 后也能通過(guò)激活活化NF-κBp 65 上調(diào)炎癥因子［30］。但是在本實(shí)驗(yàn)中，給予Na HS后，能夠降低ANP 時(shí)血漿IL-6 水平，胰腺M(fèi)PO活性。證明H2S 在大鼠精氨酸誘導(dǎo)的ANP模型中產(chǎn)生抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)治療性給予H2S 能通過(guò)抑制促炎因子IL-6 產(chǎn)生，增加抗炎因子IL-10水平，改善肺組織蛋白質(zhì)氧化作用，從而減輕急性吸入性肺損傷程度［31］。上述研究充分顯示出H2S 在多種炎癥過(guò)程中能發(fā)揮一定的抗炎作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

本實(shí)驗(yàn)中不僅發(fā)現(xiàn)H2S 對(duì)SAP 有一定的抗炎作用，而且認(rèn)為抗炎作用在Na HS 50～100 mg／kg 范圍內(nèi)會(huì)隨著H2S 濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，但不知道H2S 的作用是否會(huì)隨著濃度的升高不斷加強(qiáng)。然而，Sidhapuriwala 等［32］通過(guò)雨蛙肽誘導(dǎo)的AP 模型發(fā)現(xiàn)，給予10mg／kg NaHS 能降低血淀粉酶水平、胰腺及肺組織MPO活性及血漿中炎癥趨化因子（CCL2、CCL3、CXCL1）和黏附分子（E選擇素、P選擇素、ICAM-1、VCAM-1）表達(dá)，而給予5 mg／kg Na HS 不會(huì)對(duì)胰腺及肺損傷產(chǎn)生明顯的作用，同時(shí)，15 mg／kg Na HS 并不會(huì)使NaHS 的抗炎作用增強(qiáng)。預(yù)先給予胰腺腺泡細(xì)胞5μmol／L Na HS 后再用雨蛙肽處理，研究者發(fā)現(xiàn)IκBα降解減少，NF-κB活性降低，炎癥因子減少；而給予10μmol／L和20μmol／L Na HS 時(shí)，該作用并未得到加強(qiáng)，甚至未見Na HS 產(chǎn)生明顯的作用［10］。吸入1 ppmol 或5ppmol H2S 并不會(huì)減輕呼吸機(jī)肺損傷，但是吸入60 ppmol H2S 時(shí)卻能加速呼吸機(jī)肺損傷的炎性反應(yīng)［33］。甚至，在缺血再灌注模型中，給予不同劑量、不同濃度的Na HS，其對(duì)模型作用會(huì)出現(xiàn)劑量依賴性的U型改變［34-35］。之所以會(huì)出現(xiàn)這種情況，可能與H2S 直接釋放的多少有關(guān)系。但具體機(jī)制如何，仍有待進(jìn)一步研究。

本研究認(rèn)為內(nèi)源性H2S 的減少參與了SAP的病理生理過(guò)程；給予一定量的外源性H2S（Na HS）可通過(guò)抑制AKT磷酸化，進(jìn)而使IκBα降解減少，NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性降低，使血漿IL-6 水平下調(diào)，胰腺損傷程度減輕，對(duì)ANP 炎性反應(yīng)有一定的抑制作用；并且在一定范圍內(nèi)，H2S 抑制SAP 炎癥反應(yīng)的作用隨著其濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。雖然目前的研究尚不能對(duì)H2S在炎癥過(guò)程中的作用定論，但是這已經(jīng)充分顯示出H2S 的重要作用，也為今后治療SAP 提供了一條新的思路。

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