小鼠脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法＊

蔣 婷，楊澤龍，白 倩，張?zhí)m芳，雷 英，周廣東，劉 偉

（1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院／南充市中心醫(yī)院燒傷整形美容外科，四川南充637000；2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院／南充市中心醫(yī)院骨科，四川南充637000；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整形外科／上海市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 200011）

成體干細(xì)胞因其分布廣、增殖力強(qiáng)且具有多分化潛能而成為當(dāng)前組織工程種子細(xì)胞研究的重點(diǎn)。成體干細(xì)胞可來源于骨髓、脂肪、皮膚、肌肉、角膜等各類組織。其中以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）研究最多，應(yīng)用最廣。隨著研究的不斷深入，脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ASCs）逐漸被人 們發(fā) 現(xiàn)并廣泛研 究。1994年，Kaplan 等［1］報(bào)道了患者皮下脂肪組織存在異位成骨的現(xiàn)象，提出脂肪前體細(xì)胞具有成骨細(xì)胞分化的潛能。Zuk 等［2］于2001年從脂肪抽吸物的上層脂肪組織中成功分離培養(yǎng)出具有骨、軟骨、脂肪、肌肉等多向分化潛能的細(xì)胞。同年，Gronthos 等［3］對脂肪抽吸物培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)記進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明這些脂肪細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的表面抗原表達(dá)，CD29、CD105、CD106、CD166 等干細(xì)胞相關(guān)表面抗原均有一定的陽性率，并明確指出脂肪干細(xì)胞的確存在，脂肪干細(xì)胞的概念由此正式提出。此后人們對脂肪干細(xì)胞作了大量的研究［4-6］，但主要集中于人來源的ASCs，對小鼠脂肪組織來源的ASCs 研究相對較少。小鼠是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中常用的實(shí)驗(yàn)動物之一，本實(shí)驗(yàn)室以小鼠為動物模型進(jìn)行了大量的研究，應(yīng)用脂肪干細(xì)胞進(jìn)行多種組織工程化組織構(gòu)建，需要大量優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞。本研究以小鼠作為試驗(yàn)動物模型，擬建立一種簡單高效的體外分離培養(yǎng)小鼠脂肪干細(xì)胞（mouse adipose-derived stem cells，m ASCs）的方法，對其表面標(biāo)志和多向分化潛能進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步分析小鼠脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)特性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 6～8周齡C57BL／6雌雄小鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司）。膠原酶NB4（Serva公司），DMEM（HyClone 公司），胎牛血清（SAFC Bioscience 公司），TGF-β3、BMP6 及IGF1（R＆D公司），Ⅱ型膠原抗體（Neo Markers 公司），流式抗體（eBioscience 公司）。

1.2 m ASCs 體外分離與培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)小鼠斷頸處死后浸泡于75%乙醇中15 min，無菌條件下切取收集雙側(cè)腹股溝脂肪組織。將收集的脂肪組織剪碎后置于50 m L的離心管內(nèi)，加入適量的氯霉素浸泡15 min（以沒過脂肪組織為宜）后2～3 倍體積的PBS 沖洗3次。選擇離心半徑11.5 cm，速度為1500 r／min 離心5min 后棄上清液，再加入5 倍體積的0.1%膠原酶NB4，將離心管置于37 ℃恒溫汽浴搖床內(nèi)消化1.5～2.0 h，150 目無菌網(wǎng)篩濾去未被消化的殘余組織。選擇離心半徑11.5 cm、速度為1500 r／min 離心5 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀用PBS 洗滌2 次，以同前參數(shù)再次離心棄上清液，收集所獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù)并按1 ×105個／cm2的密度，將其種植于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入低糖DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS、100U／mL青霉素和100 mg／m L 鏈霉素）。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 天換液，待細(xì)胞生長達(dá)到90%融合時(shí)消化傳代。用0.25%胰蛋白酶消化后接種于新的培養(yǎng)皿，傳代接種的細(xì)胞密度為（0.5～1.0）×104個／cm2。當(dāng)再次達(dá)到90%融合時(shí)，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.3 生長曲線 分別取第2、8 代m ASCs，消化，制備成濃度為1 ×104個／mL單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液按每孔1mL的量接種于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，并將其分為8 組，每組3 孔。接種培養(yǎng)后第1 天用0.25%胰蛋白酶消化第1 組，制成細(xì)胞懸液1 mL，加入PBS 液19mL 稀釋成20mL 的細(xì)胞懸液，對其進(jìn)行計(jì)數(shù)并取平均值。此后每天消化一組并按同樣的方法計(jì)數(shù)取平均值，至第8 天結(jié)束。將所獲得的數(shù)據(jù)繪制生長曲線，并計(jì)算群體倍增時(shí)間。

1.4 表面標(biāo)記流式分析 用流式細(xì)胞儀對第二代細(xì)胞的表面特異性抗原進(jìn)行檢查。0.1%胰蛋白酶消化待檢細(xì)胞，收集細(xì)胞，離心5 min（1500 r／min），棄培養(yǎng)液，PBS 重懸，過單細(xì)胞濾網(wǎng)，將其制成單細(xì)胞懸液，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為（0.5～1.0）×106個／mL，吸取1 mL細(xì)胞懸液加入1.5 m L eppendorf 管中，離心，將沉淀細(xì)胞用100μL 1%BSA重懸，加入0.5μL待檢抗體，4 ℃孵育30 min，離心，PBS 沖洗。最后細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，樣品用流式細(xì)胞儀分析鑒定。分別設(shè)實(shí)驗(yàn)組、同型對照組、空白對照組。每組標(biāo)本3例，取平均值。

1.5 體外分化潛能檢測 第2 代mASCs，按1 ×104個／孔的密度接種于24 孔板，進(jìn)行成脂、成骨及成軟骨誘導(dǎo)。成脂誘導(dǎo)液配制參考文獻(xiàn)［7］，m ASCs 經(jīng)誘導(dǎo)2 周后進(jìn)行油紅染色；成骨誘導(dǎo)液及成軟骨誘導(dǎo)液配制參考文獻(xiàn)［7］，m ASCs 分別誘導(dǎo)4 周后進(jìn)行茜素紅染色以觀察鈣鹽沉積情況；行Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原的分泌情況。

1.6 特殊染色及免疫組化染色 油紅染色：細(xì)胞經(jīng)4%甲醛4 ℃固定1 h，蒸餾水沖洗，加入60%異丙醇，室溫放置1 min，吸盡后加入2%油紅試劑（wt／vol），室溫放置5～10 min，60%異丙醇洗去多于染液，蒸餾水沖洗后觀察。

Alizarn Red染色：細(xì)胞經(jīng)70%冷乙醇4℃固定1 h，蒸餾水沖洗3 遍，茜素紅染液室溫作用10 min，蒸餾水沖洗多余染液，倒置相差顯微鏡觀察拍照。

Ⅱ型膠原免疫組化染色：細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛4 ℃固定10～15 min，PBS 沖洗3 min，（0.25% Triton-100，5%DMSOPBS）穿膜處理10 min，PBS 洗3 次，每次5 min，非特異性抗原封閉，加入Ⅱ型膠原抗體4 ℃過夜，抗小鼠二抗37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗3min，DAB 顯色，封片，鏡檢拍照。

2 結(jié) 果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長及形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 原代分離的小鼠脂肪干細(xì)胞呈體積較小的圓球形，1～2 h 開始貼壁生長，6 h 左右細(xì)胞伸展開來，呈短梭形，胞體可形成具有較強(qiáng)折光性的細(xì)胞外基質(zhì)，高倍鏡下細(xì)胞輪廓清晰（圖1）。5 d左右達(dá)到90%以上匯合狀態(tài)時(shí)傳代，傳代接種的細(xì)胞密度為（0.5～1.0）×104個／cm2，傳代后細(xì)胞增殖迅速，常于傳代后3 d 再次接近匯合狀態(tài)。傳代到第10 代仍有很強(qiáng)的增殖能力。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察m ASCs 的原代細(xì)胞形態(tài)

2.2 生長曲線 生長曲線顯示培養(yǎng)的第2、8 代細(xì)胞均具有很強(qiáng)的分裂增殖能力，均存在24 h 停滯生長期，第3～4 天體外擴(kuò)增速度相似，為對數(shù)增殖期。而在第6 天時(shí)第2、8 代細(xì)胞生長均處于停止?fàn)顟B(tài)。該研究結(jié)果表明，m ASCs 第2、8 代細(xì)胞傳代接種后的潛伏期、對數(shù)生長期、平臺期無顯著差異（圖2），群體倍增時(shí)間大約為48 h，傳10 代后細(xì)胞無明顯的衰老征象。

圖2 生長曲線

2.3 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 第2代小鼠脂肪干細(xì)胞表達(dá)CD34（10.97±2.03）%、CD105（11.78±1.56）%、CD133（1.63±0.38）%，高表達(dá)Sca-1（80.57±5.71）%，幾乎不表達(dá)CD45（0.07±0.03）%、SSEA-1（0.02±0.01）%。

2.4 體外分化潛能檢測 成脂誘導(dǎo)7 d 左右，鏡下觀察有脂滴出現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，脂滴逐漸增多，變大，2 周時(shí)停止誘導(dǎo)，油紅染色顯示脂滴呈桔紅色（圖3A）；對照組無脂滴出現(xiàn)，油紅染色呈陰性（圖3B）。成骨誘導(dǎo)4 周行茜素紅染色，誘導(dǎo)組有鈣結(jié)節(jié)形成，染色呈紅色（圖3C）；對照組染色呈陰性（圖3D）。成軟骨誘導(dǎo)6 d 左右，誘導(dǎo)組有部分細(xì)胞聚集成小球狀，非誘導(dǎo)組則無，誘導(dǎo)4 周時(shí)Ⅱ型膠原免疫組化染色誘導(dǎo)組表達(dá)軟骨特異基質(zhì)Ⅱ型膠原，染色呈棕色（圖3E），對照組無陽性染色出現(xiàn)（圖3F）。

圖3 m ASCs 體外分化潛能檢測（×100）

3 討 論

組織工程技術(shù)是目前最有前景的生理性修復(fù)技術(shù)。然而，種子細(xì)胞來源不足、功能老化等問題嚴(yán)重限制了其發(fā)展與應(yīng)用。脂肪干細(xì)胞因其體內(nèi)分布廣，取材創(chuàng)傷小，細(xì)胞獲得量大且擴(kuò)增能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種有希望的種子細(xì)胞。研究表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在體外特定條件下可分化為多種細(xì)胞類型及表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)抗原［8-11］。小鼠動物模型取材方便，可重復(fù)性強(qiáng)，便于有關(guān)基礎(chǔ)研究的實(shí)施等優(yōu)點(diǎn)目前應(yīng)用廣泛。小鼠脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法主要參照人脂肪干細(xì)胞，目前通常采用Ⅰ型膠原酶進(jìn)行消化［12-14］。脂肪組織主要是由大量脂肪細(xì)胞集聚而成，疏松結(jié)締組織將成群的脂肪細(xì)胞分隔成許多脂肪小葉。疏松結(jié)締組織中含有除Ⅰ型膠原外的多種膠原纖維及蛋白多糖和糖蛋白等，本研究應(yīng)用膠原酶NB4（包含Ⅰ型膠原酶，Ⅱ型膠原酶和中性蛋白酶）消化小鼠腹股溝皮下脂肪組織，組織消化更完全，細(xì)胞獲得量更大。小鼠脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基通常為DMEM／F12 加胎牛血清（5%或10%）［15-16］，本法采用低糖DMEM加10%胎牛血清，貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞增殖迅速，體外多次傳代仍保持較強(qiáng)的增殖能力。原代分離的小鼠脂肪干細(xì)胞呈集落狀生長，傳代后的細(xì)胞生長速度較原代細(xì)胞明顯增快，體外多次傳代后仍保持較強(qiáng)的增殖能力。通過測定小鼠脂肪干細(xì)胞的生長曲線，證實(shí)其體外培養(yǎng)時(shí)分裂增殖能力強(qiáng)，潛伏期較短。本研究進(jìn)一步鑒定該分離培養(yǎng)方法所獲得的細(xì)胞表面標(biāo)記及多向分化潛能，以證實(shí)其干細(xì)胞特性。對小鼠脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)后，油紅染色胞質(zhì)中脂滴呈桔紅色，成骨誘導(dǎo)后有鈣結(jié)節(jié)形成，成軟骨誘導(dǎo)后表達(dá)軟骨特異基質(zhì)Ⅱ型膠原，表明其具有向脂肪、骨及軟骨分化潛能。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒 定，CD34、CD105陽 性，Sca-1高 表 達(dá)，不 表 達(dá)CD45及SSEA-1，其具有與文獻(xiàn)報(bào)道相似的表面標(biāo)記［15］。在人脂肪干細(xì)胞中，CD105 與軟骨分化潛能具有高度相關(guān)性［17］，本法獲得的小鼠脂肪干細(xì)胞第2 代CD105 表達(dá)量為（11.78±1.56）%，其與軟骨潛能相關(guān)性有待進(jìn)一步證實(shí)。結(jié)果表明，本研究從小鼠脂肪組織中分離到的間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，及與文獻(xiàn)報(bào)道相一致的表面標(biāo)記。本分離培養(yǎng)方法操作簡單、易于推廣、細(xì)胞獲得量大、質(zhì)量優(yōu)良，能很好地滿足組織構(gòu)建對種子細(xì)胞量大質(zhì)優(yōu)的需求。

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