Wnt10b 肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)＊

浮鳳洲，范曉麗，孫 莉，△

（桂林醫(yī)學(xué)院臨床：1.醫(yī)學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541004）

肝細(xì)胞肝癌（以下簡稱肝癌）是我國最常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高病死率的特點，近年來其發(fā)病率呈增高趨勢。Wnt 通路由多種癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質(zhì)組成，是一種與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育以及腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白信號傳導(dǎo)通路［1］。Wnt 通路與腫瘤相關(guān)的研究已成為當(dāng)前的研究熱點。Wnt 信號通路中與β-catenin 聚集密切相關(guān)的信號通路稱為經(jīng)典Wnt 信號通路，除此以外的Wn t 信號通路稱為非經(jīng)典Wnt 信號通路。Wnt10b 是Wnt 家族成員之一，由2.2 kb的m RNA編碼的389個氨基酸構(gòu)成，相對分子質(zhì)量為43 ×103。研究證實Wnt10b 通過經(jīng)典途徑在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，并且在體外肝癌細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)Wnt10b高表達(dá)［2］。本研究采用熒光定量PCR和Western blot 技術(shù)分別檢測33例肝癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中Wnt10b m RNA及蛋白的表達(dá)，初步探討Wnt10b 在肝癌中的表達(dá)規(guī)律及其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 收集2012年6月至2013年5月桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌手術(shù)標(biāo)本33對，按照C1、N1、C2、N2……C32、N32、C33、N33 編號，C代表癌組織，N代表癌旁組織。所有入組患者術(shù)前均未經(jīng)放化療及其他抗癌治療。

1.1.2 試劑 RNAiso 試劑、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒均購自大連Takara 公司，BCA蛋白定量試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司，鼠抗人單克隆抗體及羊抗鼠IgG購自美國Aviva Systems Biology公 司，β-actin鼠 抗 人 單 克 隆 抗 體 購 自 美 國Santa Cruz 公司。引物均由Invi t rogen 公司合成。Wnt10b 正向引物：5′-TTG ATA CCC ACA ACC GCA AT-3′；Wnt10b 反向引物：5′-GTG CTC GCT CAC AGA AGT CAG G-3′，β-actin正向引物：5′-GGC ATC CTC ACC CTG AAG T-3′，β-actin 反向引物：5′-GGG ATA GCA CAG CCT GGA T-3′，

1.1.3 儀器 ABI 7500 FAST熒光定量PCR擴(kuò)增儀，美國ABI 公司；紫外分光光度計，美國ABI 公司；電泳轉(zhuǎn)膜儀，北京六一儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 分離腫瘤及癌旁組織 手術(shù)標(biāo)本切除后立即取材，避開腫瘤壞死與出血部位，無菌條件下取腫瘤組織及癌旁組織（用工具尺測量距瘤塊外緣3 cm以上）各2 塊，標(biāo)本大小約1 cm ×1cm ×1 cm，一塊置于甲醛固定液中固定，制做組織切片并進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，邀2 名病理學(xué)專家對切片進(jìn)行病理學(xué)鑒定，另一塊在組織離體后20 min 內(nèi)置于液氮中速凍，然后儲存于-80 ℃冰箱，用于RNA和蛋白提取。

1.2.2 總R N A和蛋白的提取 取凍存的組織標(biāo)本，每例組織標(biāo)本稱取100 mg 加入1 m L RNAiso，在冰浴中進(jìn)行勻漿處理，直至勻漿液呈顆粒無透明狀，向勻漿裂解液中加入0.2 m L的氯仿，蓋緊離心管蓋，用手猛烈振蕩15 s，待乳液充分乳化，無分相現(xiàn)象后，室溫靜置5 min，然后12000 r／min 4℃離心15 min，取出分相清楚的離心管，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫靜置10 min，12000 r／min 4 ℃離心10 min，有沉淀析出，棄上清液，75%乙醇洗滌沉淀后小心棄去乙醇，室溫干燥沉淀5 min，加入0.04 m L焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解沉淀。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的均一性和完整性，用紫外分光光度計測定總RNA的純度和含量，A260／A280在1.8～2.0之間時，讀取RNA濃度。

1.2.3 cDNA合成 按PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒說明書分兩步進(jìn)行cDNA合成，第一步：取總RNA 3.0μL，Oligo d T Primer 1.0μL，d NTP mixture 1.0 μL，RNase free d H2O 4.5μL，反應(yīng)條件為42 ℃2 min；第二步：向第一步反應(yīng)管中加5 ×PrimeScript Buffer 4.0μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，PrimeScript RTase 1.0 μL，RNase Free d H2O 4.5μL，反應(yīng)條件為37 ℃15 min，85 ℃5 s。反應(yīng)產(chǎn)物放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 熒光定量PCR采用SYBR法，使用ABI 7500 Fast Real Time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增和結(jié)果分析，反應(yīng)體系：2 ×SYBR Premix Ex Taq TMⅡ10.0μL，上、下游引物各0.8 μL，50 ×ROX Reference DyeⅡ0.4μL，cDNA模板2μL，加去RNase 水至20μL。兩步法PCR擴(kuò)增：95℃30 s；95℃3 s，60℃30 s，40個循環(huán)。每個樣品均作復(fù)管反應(yīng)，重復(fù)3次，以DEPC 處理水作為陰性對照。所有樣品均在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行Wnt10b m RNA檢測。采用2-△△CT法對擴(kuò)增產(chǎn)物定量計算，△CT＝CTWnt10b-CTβ-actin，△△CT＝△CT 癌-△CT癌旁＝（CTwnt10b-CTβ-actin）癌-（CTWnt10b-CTβ-actin）癌旁。C代表Cycle（擴(kuò)增循環(huán)數(shù)），T代表threshol ds（擴(kuò)增域值），CT值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.2.5 PCR產(chǎn)物測序 在CEQ8000 測序儀上進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序，以鑒定PCR產(chǎn)物特異性。

1.2.6 Western blot 檢測Wnt10b 蛋白的表達(dá) 分別提取肝癌和癌旁組織的總蛋白，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)移電泳產(chǎn)物至硝酸纖維素膜上，于5%脫脂奶粉中室溫封閉1.5 h。加一抗（鼠抗人Wnt10b 單克隆抗體，1∶1500 稀釋），置于4℃冰箱反應(yīng)過夜。TBST洗滌3遍，每次10 mi n，加二抗（羊抗鼠Ig G抗體，1∶1000 稀釋），室溫培育2 h，暗室發(fā)光。以鼠抗人β-actin單克隆抗體（1∶1500稀釋）作為內(nèi)參照，Wnt10b 蛋白的相對表達(dá)量以Wnt10b／β-actin 灰度值比表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，癌組織與癌旁組織比較采用配對t檢驗，Wnt10b mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的比較采用兩樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α＝0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色鑒定組織病理特征 共收集標(biāo)本33對，通過HE 染色，病理鑒定所有組織標(biāo)本病理特征，高分化肝癌7 對，中分化肝癌17 對，低分化肝癌9 對，見圖1。

圖1 癌及癌旁組織病理學(xué)圖片（HE ×200）

2.2 組織總R N A提取及實時定量P C R采用Trizol 法提取組織總RNA，取產(chǎn)物5μL 上樣量于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果可見18S 和28S 兩條清晰條帶，提示總RNA高質(zhì)量提取成功。將RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR檢測，通過熒光定量PCR擴(kuò)增曲線，產(chǎn)物到達(dá)平臺期，對融解曲線分析，可以看到單一的峰型，說明擴(kuò)增產(chǎn)物有較高的特異性。PCR產(chǎn)物比較采用CT法定量，根據(jù)2-ΔΔCt值反映出Wnt10b 在不同樣本的表達(dá)水平，見圖2。

2.3 Wnt10b m RNA在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)差異 將每個樣品的2-△△CT值作為觀察值，反映Wnt10bmRNA在33 對肝癌組織標(biāo)本中的表達(dá)量，對Wnt10b mRNA在肝癌和癌旁組織中的2-△△CT進(jìn)行配對t 檢驗，結(jié)果顯示：Wnt10b mRNA在肝癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

圖2 Wnt10b mRNA在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)

2.4 Wnt10b 蛋白在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)差異 Western blot 結(jié)果顯示：肝癌組織中Wnt10b 蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。Wnt10b 和βactin 灰度值見圖3。

2.5 肝癌組織中Wn t 10 bmRNA的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 肝癌組織中Wnt10b mRNA的表達(dá)與患者的年齡、性別、組織分化程度及臨床分期無關(guān)（P＞0.05），見表3。

表2 癌組織和癌旁組織中Wnt10b mRNA和 蛋白的表達(dá)（±s）

表2 癌組織和癌旁組織中Wnt10b mRNA和 蛋白的表達(dá)（±s）

a：P＜0.01，與癌旁組織比較。

組別 n mRNA 2-△△CT蛋白質(zhì)癌組織 339.4441±7.6787a 0.2439±0.0826值a 335.3547±5.79050.1903±0.0936癌旁組織

圖3 Western blot 檢測Wnt10b 在肝癌及癌旁組織中蛋白的表達(dá)

表3 組織中Wnt10b 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的比較（±s）

表3 組織中Wnt10b 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的比較（±s）

P1：高分化組和中分化組比較；P2：中分化組和低分化組比較；P3高分化組和低分化組比較；P4：Ⅱ期和Ⅲ期比較；P5：Ⅲ期和Ⅳ期比較；P6：Ⅱ期和Ⅳ期比較。

項目 n Wnt10b mRNA 2-△△CT 值P 0.6703 男 229.0325±7.7348 女 1110.2672±7.8693年齡 0.9465 ＜60 歲 209.5181±8.5656 ≥60 歲 139.3301±6.4064分化程度 高 78.9668±8.54420.9730（P1） 中 179.0941±8.17660.6685（P2） 低 910.4763±6.76230.6986（P3）臨床分期 Ⅱ 108.3789±5.86620.5679（P4） Ⅲ 1510.2817±8.18100.7207（P5） Ⅳ 89.0398±8.74130.8572（P6）性別

3 討 論

Wnt 經(jīng)典信號通路在調(diào)節(jié)組織器官的生成、增殖和分化，以及維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中起重要作用［3］。經(jīng)典Wnt 信號通路的構(gòu)成和激活機(jī)制的研究已相對完善，人們認(rèn)識到經(jīng)典Wnt 信號通路并不僅是一條單純的線性信號傳導(dǎo)通路，而是一條多基因參與，擁有多個作用位點的相對開放的信號途徑，參與該途徑的蛋白及其作用機(jī)制相對復(fù)雜。Wnt 蛋白是Wnt 基因編碼的分泌性蛋白，屬于經(jīng)典途徑的有：Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、Wnt10b［2］。之前的研究表明Wnt 經(jīng)典信號通路參與了消化系統(tǒng)腫瘤和女性生殖系統(tǒng)腫瘤的形成。研究證實，Wnt2 在食管細(xì)胞癌中通過激活經(jīng)典信號通路，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的生長［4］；據(jù)報道，Wnt1［5］、Wnt2［6］在胃癌組織中異常表達(dá)。趙玉潔等［7］研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a 在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織及宮頸鱗癌組織中的表達(dá)逐漸升高，可能參與了宮頸鱗狀上皮的惡性轉(zhuǎn)化過程，促進(jìn)宮頸上皮內(nèi)瘤變向?qū)m頸鱗癌轉(zhuǎn)化。另研究發(fā)現(xiàn)，Wnt10a 高表達(dá)時，腎癌細(xì)胞株的β連環(huán)蛋白（β-catenin）聚集、細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）與禽類髓細(xì)胞病毒致癌基因同系物（c-myc）表達(dá)增加［8］，而當(dāng)Wnt10b的表達(dá)被抑制后，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin 聚集減少，cyclin D1 與cmyc 表達(dá)下降，同時也導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移、侵襲力等下降［9］。

研究表明，Wnt 經(jīng)典信號通路各蛋白表達(dá)水平的改變及相關(guān)基因的突變參與了原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展［10-12］。30%～70%的肝癌中發(fā)現(xiàn)Wnt 經(jīng)典通路關(guān)鍵因子β-catenin 在胞內(nèi)聚集［13］。Wei 等［14］發(fā)現(xiàn)Wnt1 在肝癌組織及其細(xì)胞系中表達(dá)增高，Wnt1 蛋白抗體能夠降低肝癌細(xì)胞系Huh7 和Hep40 的增生及生存能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制經(jīng)典Wnt 信號通路，而對正常肝細(xì)胞生長無影響。同樣有研究認(rèn)為Wnt1 可以作為一個重要指標(biāo)預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)［15］。Yoshikawa 等［16］發(fā)現(xiàn)7／10 的肝癌和1／2 的結(jié)腸癌細(xì)胞株表達(dá)大量的Wnt10b mRNA。Yuzugullu 等［2］研究發(fā)現(xiàn)在高分化和低分化的11 種肝癌細(xì)胞系中Wnt3 和Wnt10b 均表達(dá)上調(diào)。因此，Wnt10b 的異常表達(dá)參與了肝癌的發(fā)生，可能扮演著一個重要角色。本文從臨床肝癌組織著手，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)和Western blot 技術(shù)，對肝癌組織中Wnt10b 基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平進(jìn)行相對準(zhǔn)確的定量檢測和分析，敏感性和特異性較高。通過分析肝癌組織和癌旁組織中Wnt10b 基因和蛋白的表達(dá)變化規(guī)律，以研究Wnt10b 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

研究結(jié)果示，Wnt10b mRNA及蛋白在肝癌組織中表達(dá)水平高于癌旁組織，研究結(jié)果與Yuzugullu 等［2］的一致，由結(jié)果可見Wnt10b 基因和蛋白表達(dá)趨勢呈現(xiàn)出一致性，作者分析Wnt10b 表達(dá)的上調(diào)可能是在基因轉(zhuǎn)錄水平，而Wn t 10b 在肝癌組織的異常高表達(dá)提示，Wnt10b 可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著癌基因樣的作用，在正常肝細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中起著正向促進(jìn)作用，而非抑制作用。而Wnt10b m RNA和蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度及臨床分期無關(guān)，作者分析可能存在以下4 方面原因：（1）樣本含量小、存在樣本選擇偏倚和信息偏倚；（2）以及RT-PCR和Western blot 結(jié)果出現(xiàn)假陽性；（3）人體組織中基因和蛋白表達(dá)的個體差異比較大；（4）肝癌的發(fā)生發(fā)展是一系列基因和蛋白的參與，存在著多種信息傳導(dǎo)通路異常傳導(dǎo)的病理過程，Wnt10b 對于肝癌不是一個絕對獨(dú)立的因素，只是整個肝癌信號網(wǎng)絡(luò)中的一個點。根據(jù)Wnt 信號通路的傳導(dǎo)機(jī)制，Wn t 10b 在整個Wn t 信號通路傳導(dǎo)過程中的啟動階段發(fā)揮重要作用，從Wnt10b 的異常表達(dá)到一系列靶基因的激活則可能受多種因子和信號通路的調(diào)節(jié)，而非簡單的線性傳導(dǎo)。作者認(rèn)為，進(jìn)一步研究Wnt10b 下游靶基因的作用機(jī)制，探明Wnt10b 介導(dǎo)的整條Wnt 信號通路中的各個環(huán)節(jié)以及尋找通路中抑制腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵靶點十分重要。故本課題下一階段將進(jìn)行Wnt10b 在肝癌中下游靶基因的作用機(jī)制的研究，以及利用構(gòu)建慢病毒載體和基因干擾技術(shù)探討Wnt10b 基因沉默后對肝癌細(xì)胞株的影響。

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