結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖及細胞周期的影響

張 劍，吳 敏，張自森，王利娟，張紅巧，師廣勇，巴 楠，閆 琳，鄭曉珂，邢 鑫

（鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科 450052）

結(jié)腸癌是常見的消化系惡性腫瘤，其在歐美國家發(fā)病率較高，在發(fā)展中國家發(fā)病率較低，但近年來，隨著生活水平及飲食習(xí)慣的改變，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率明顯升高。SLP-2基因?qū)儆趕tomatin基因家族成員，是2001年新發(fā)現(xiàn)的一個基因［1］，近年來的研究顯示，SLP-2 在多種惡性腫瘤中過表達，可能是一個新的腫瘤相關(guān)基因［2-6］。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測SLP-2 在人結(jié)腸癌配對組織中的表達，并通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）下調(diào)結(jié)腸癌細胞HCT-116 中SLP-2 的表達，檢測轉(zhuǎn)染后HCT-116 細胞中SLP-2 的表達情況，并檢測轉(zhuǎn)染后HCT-116 細胞增殖及周期的變化，旨在探討結(jié)腸癌中SLP-2 的表達特點及SLP-2 對結(jié)腸癌細胞的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 結(jié)腸癌組織及距離癌組織邊緣大于5 c m的癌旁正常結(jié)腸組織為鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院2010年1月至2011年1月手術(shù)切除結(jié)腸癌標本，共50例，其中男27例，女23例，年齡40～72 歲，中位年齡63 歲。所有標本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌，術(shù)前未接受過放、化療。臨床分期按TNM分期標準（AJCC）2010年第7 版，其中早期結(jié)腸癌（Ⅰ＋Ⅱ期）13例，晚期結(jié)腸癌（Ⅲ＋Ⅳ期）37例。

1.2 細胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細胞系HCT-116 購自上海中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。用含抗菌藥物和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，3～5 d傳代1 次。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建的SLP-2s i RNA序列正向引物：5′-UGC UGC CUG AUU UAU CUG UUC AGC C-3′，反向引物：5′-GGC UGA ACA GAU AAA UCA GGC AGC A-3′由上海吉瑪公司設(shè)計合成。細胞按5 ×104／孔接種于24 孔板上，參考LipofectamineTM2000說明書，50μL的RPMI-1640 無 血 清 培養(yǎng)液中加入20 pmol SLP-2 siRNA混勻，Lipofectamin 試劑，用50μL 無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋1μL Lipofectamin 試劑，混勻。將稀釋好的SLP-2 siRNA和Lipofectamin試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20 min，以形成SLP-2 siRNA／Lipofectamin 復(fù)合物；將以上混合液加到含有細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中，在5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育24 h 后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)為實驗組。實驗設(shè)陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）和空白對照組（不轉(zhuǎn)染siRNA）。

1.4 RNAi 有效時間點的篩選 分別于轉(zhuǎn)染后24、48 和72 h收集細胞，進行RT-PCR 及Wester blot 檢測，比較上述3 個時間點的siRNA干擾效果的差異，從中找到最為有效的時間點。SLP-2 擴增片段長度：500 bp，上游引物5′-CTG GAG CCT GGT TTG AAC AT-3′；下游引物5′-AGG ATC TGG GCC TGT TTC TT-3′。內(nèi)參β-actin 擴增片段長度242 bp，上游引物5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG ACC-3′；下游引物5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT AGA-3′。引物由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系：2 ×Taq PCR Master Mix 12.5μL，SLP-2 及內(nèi)參上、下游引物各1μL，cDNA 2μL，dd H2O補至25μL。PCR反應(yīng)條件，預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，50 s，30 循環(huán)；延伸72 ℃，7 min。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶圖像凝膠成像儀掃描，以SLP-2 與β-actin 的灰度值的比值表示SLP-2 mRNA的相對表達水平。SLP-2 單克隆抗體和抗β-actin 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司。提取HCT-116細胞總蛋白，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳，穩(wěn)流冰浴電轉(zhuǎn)膜，分別與抗辣根過氧化物酶連接的二抗（美國Santa Cruz 公司）孵育，DAB 顯色拍照。

1.2 免疫組織化學(xué) 鼠抗人SLP-2 單克隆抗體稀釋度為1∶200，購自美國Proteintech 公司。免疫組織化學(xué)試劑盒購自邁新公司。用已知陽性片（子宮內(nèi)膜癌切片，為公司提供）作陽性對照用PBS 代替一抗作陰性對照。操作步驟按試劑盒說明書進行。結(jié)果判定標準參照文獻［7］，由兩位高年資病理醫(yī)師在雙盲條件下進行評分，每張切片根據(jù)陽性細胞百分數(shù)及陽性細胞染色程度進行評分。細胞膜及細胞質(zhì)染色程度評分由每張切片的大多數(shù)細胞染色情況決定，0 分：無著色，1分：淺黃色為，2 分：黃色，3 分：棕黃色。陽性細胞百分數(shù)評分，0 分：沒有陽性細胞，1 分：1%～25%陽性，2 分：26%～50%陽性，3分：51%～75%陽性，4 分：＞75%陽性。二者分數(shù)相乘為總分，≥8 分為高表達，＜8 分為陰性或低表達。

1.5 噻唑藍（MTT）試驗 取轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h 轉(zhuǎn)染組、陰性對照組及空白對照組的HCT-116 細胞，每孔加入200μL 5 mg／mL MTT，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。棄MTT，每孔加入200μL 二甲基亞砜（DMSO），酶標儀測定490 nm處的吸光度（OD）值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 收集轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA 48 h 后轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組HCT-116 細胞，參考文獻［8］處理后，采用流式細胞儀檢測細胞周期。實驗中每組各設(shè)3 個平行對照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，計數(shù)資料采用率表示，結(jié)腸癌配對組織中SLP-2 蛋白表達的比較采用配對χ2檢驗，轉(zhuǎn)染SLP siRNA后各組HCT-116 細胞中SLP-2 mRNA和蛋白的表達量以及轉(zhuǎn)染SLP siRNA后各組HCT-116 細胞周期和增殖能力的比較采用方差分析，組間比較用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SLP-2 蛋白在結(jié)腸癌及癌旁正常結(jié)腸組織的表達SLP-2在癌旁正常結(jié)腸組織中多為陰性或低表達，高表達例數(shù)為11例（22.0%），在結(jié)腸癌組織中則多呈高表達，高表達例數(shù)分別為35例（70.0%）。二者的高表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝23.188，P＝0.000），見圖1。

2.2 SLP-2 蛋白表達與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系 見表1。

表1 SLP-2 的表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

圖2 轉(zhuǎn)染48 h 后各組HCT-116 細胞中SLP-2 m RNA的表達

2.3 siRNA的轉(zhuǎn)染及有效時間點的確定 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA序列后，HCT-116 目的基因SLP-2 的表達呈現(xiàn)出明顯降低的趨勢。從轉(zhuǎn)染后24 h 開始，SLP-2 基因的表達就有所下降，轉(zhuǎn)染后48 h 表達量最低。72hSLP-2 基因表達量有所回升，但仍維持在較低水平。因轉(zhuǎn)染后48 h 后表達抑制率最高，表達降低幅度最大，因此該時間點被選做轉(zhuǎn)染有效時間點。轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組SLP-2 mRNA表達水平為0.55±0.26，空白對照組為1.42±0.31，陰性對照組為1.35±0.38，3 者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝6.764，P＝0.029），見圖2。轉(zhuǎn)染48 h 后，實驗組SLP-2 蛋白表達水平為0.61±0.30，空白對照組為1.38±0.42，陰性對照組為1.47±0.35，3 者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝5.171，P＜0.05），見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染48 h 后各組HCT-116 細胞中SLP-2 蛋白的表達

2.4 轉(zhuǎn)染SLP-2 s i RNA后HCT-116細胞增殖力的變化 MTT法檢測結(jié)果顯示，實驗組細胞與陰性對照組和空白對照組比較，增殖力下降（P＜0.05），見表2。

2.5 轉(zhuǎn)染SLP-2 s i RNA后HCT-116 細胞周期的變化 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組G1期細胞比例增加，S期細胞比例下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3，圖4。

表2 SLP-2 siRNA對HCT-116 細胞增殖的 影響（n＝3，±s）

表2 SLP-2 siRNA對HCT-116 細胞增殖的 影響（n＝3，±s）

a：P＜0.05，與實驗組比較。

組別 轉(zhuǎn)染后24 h 轉(zhuǎn)染后48 h 轉(zhuǎn)染后72 h 轉(zhuǎn)染后96 h實驗組 0.331±0.0280.438±0.0390.636±0.1150.857±0.045陰性對照組 0.353±0.0470.604±0.035a 1.010±0.097a 1.459±0.400a空白對照組 0.341±0.0290.663±0.067a 1.061±0.185a 1.747±0.101a F 0.27917.0058.52510.825 P 0.7660.0030.0180.010

表3 3 組HCT-116 細胞的細胞周期變化（n＝3，±s，%）

表3 3 組HCT-116 細胞的細胞周期變化（n＝3，±s，%）

a：P＜0.05，與實驗組比較。

組別 G1期 S期 G2／M期SLP-2 siRNA轉(zhuǎn)染組69.8±2.418.3±2.712.0±1.6陰性對照組 53.6±4.1a 30.9±3.6a 15.3±2.1空白對照組 57.5±3.7a 28.7±5.3a 13.5±3.3

圖4 SLP-2 siRNA對HCT-116 細胞周期的影響

3 討 論

SLP-2 是2000年由美國耶魯大學(xué)病理科首次發(fā)現(xiàn)并命名的一個新基因，屬于stomatin基因超家族。人SLP-2基因定位于9p13.1，編碼長約1500 bp 的mRNA，其編碼的蛋白含357 個氨基酸，相對分子質(zhì)量為3.9 ×103。SLP-2 蛋白是一種細胞膜相關(guān)蛋白，可能作為外周膜蛋白起作用，調(diào)控離子通道和脂筏結(jié)構(gòu)［1，8］。SLP-2 蛋白還存在于細胞線粒體中，是一種線粒體相關(guān)蛋白，可能參與調(diào)節(jié)與其結(jié)合的線粒體膜相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性，影響ATP 的合成［7，9］。

近年 來的研究顯示，SLP-2基因在食管鱗癌［7，10］、肺 癌［2］、子宮內(nèi)膜癌［4］、乳腺癌［5，11］、胃癌［3，6］等惡性腫瘤中高表達。且SLP-2 反義基因可抑制某些惡性腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移，促進其凋亡，推測SLP-2 可能促進癌細胞的生長、增殖，抑制癌細胞凋亡，并參與癌細胞的轉(zhuǎn)移［4，7，10］。這些研究表明，SLP-2 可能是一個新的惡性腫瘤相關(guān)基因。但目前有關(guān)SLP-2 在結(jié)腸癌中的表達情況及作用機制的研究較少。

本研究采用免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)SLP-2 在結(jié)腸癌組織中表達升高，通過分析結(jié)腸癌患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)在較晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中SLP-2 表達升高更為明顯。為進一步研究SLP-2 在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本課題組設(shè)計合成SLP-2 siRNA，將其轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT-116細胞，采用MTT及流式細胞儀檢測HCT-116 細胞增殖及細胞周期的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA后，HCT-116 細胞的增殖活性下降，G1期細胞數(shù)增多，S期細胞數(shù)減少。提示SLP-2 可能通過調(diào)節(jié)細胞周期促進結(jié)腸癌細胞的增殖。

SLP-2 在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚未明確，推測可能與調(diào)節(jié)細胞信號傳導(dǎo)通路及線粒體能量代謝有關(guān)。SLP-2蛋白作為一種膜相關(guān)蛋白，與細胞信號通路密切相關(guān)，可能通過對信號通路的調(diào)節(jié)參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有文獻報道，SLP-2 蛋白可能通過與Rho 家族蛋白的相互作用，參與細胞信號傳導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［12］。祁代華等［13］的研究也顯示，結(jié)直腸癌組織中SLP-2 與Rho 家族CDC42 蛋白表達呈正相關(guān)，且與結(jié)直腸癌的Dukes 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA降低Hela 細胞中SLP-2 的表達，可引起線粒體膜電勢的降低［9］；轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA降低食管癌KYSE150 細胞中SLP-2 表達后，細胞線粒體膜電勢和ATP水平均降低，同時伴細胞運動能力和增殖能力減弱［7］；推測SLP-2可能通過影響細胞的能量代謝參與腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。目前對SLP-2 的研究不多，對SLP-2 在惡性腫瘤中作用機制的研究仍處于起步階段，有待進一步深入探索。

本研究發(fā)現(xiàn)SLP-2 在結(jié)腸癌中表達升高，SLP-2 基因沉默可使HCT-116 細胞被阻滯在G1期，增殖活性降低。該研究結(jié)果對闡明結(jié)腸癌的發(fā)病機制及尋找新的結(jié)腸癌治療分子靶點具有一定意義。

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