自噬與紫杉醇敏感性

劉穗玲 李小毛

自噬是指胞漿內(nèi)大分子物質(zhì)和細胞器在膜包囊泡中大量降解的生物學過程。細胞通過自噬作用降解多余的或受損的大分子物質(zhì)及細胞器，重新利用降解產(chǎn)物，維持細胞內(nèi)合成和分解代謝的平衡，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。自噬廣泛存在于真核生物的病理生理過程中。研究發(fā)現(xiàn)，許多抗腫瘤藥物可誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬，且自噬可影響腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。紫杉醇是目前廣泛應用的廣譜抗腫瘤藥物，主要通過誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)生作用，近年研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇可誘導自噬，現(xiàn)對自噬與紫杉醇敏感性的相關(guān)研究綜述如下。

一、自噬與抗腫瘤藥物

1.自噬概述

根據(jù)物質(zhì)到達溶酶體腔的方式不同，自噬可分為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導的自噬。通常所指的自噬主要是指巨自噬。自噬過程主要包括自噬的誘導、前自噬結(jié)構(gòu)(PAS)的形成、自噬體的延長及自噬溶酶體形成和降解等過程。電子顯微鏡可觀察到自噬體位于細胞質(zhì)中，呈雙層膜結(jié)構(gòu)，其中包裹著尚未消化的線粒體等胞內(nèi)細胞器。吖啶橙(AO)染色、丹酰戊二胺(MDC)染色可標記自噬體，有助于自噬體的識別。

自噬過程涉及多種自噬相關(guān)基因(Atg)，Atg基因編碼相應的自噬相關(guān)蛋白。眾多自噬相關(guān)蛋白中，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)和Beclin1蛋白尤其引人注目。 LC3是酵母Atg8在哺乳動物的同源物編碼的蛋白，附著在自噬體膜的內(nèi)側(cè)及外側(cè)。在自噬體與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體后，膜表面的LC3脫落，膜內(nèi)面的LC3被水解，由于LC3出現(xiàn)在自噬體形成的全過程，LC3被認為是自噬的有效和特殊的分子標記物[1]。Beclin1是酵母Atg6的同源基因，定位于染色體17q21上。Beclin1蛋白是第一個確定的、誘導哺乳動物自噬的自噬相關(guān)蛋白，在自噬的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。

自噬主要受兩個復合體的調(diào)節(jié)，即哺乳動物雷帕霉素靶向蛋白(mTOR)復合體和Beclin1復合體，而這兩個復合體又接受多個調(diào)節(jié)腫瘤生長的信號通路的調(diào)節(jié)。mTOR有兩種復合體，包括mTORC1和mTORC2。mTOR受調(diào)節(jié)細胞生長增殖的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-AKT)信號轉(zhuǎn)導通路和能量感受器AMPK通路的調(diào)節(jié)，PI3K-AKT的激活導致mTORC1激活，抑制自噬。AMPK通路的激活抑制mTORC1，激活自噬。10號染色體同源丟失性磷酸酶與張力蛋白(PTEN)在PI3K-AKT通路的上游對其產(chǎn)生抑制作用，因而對自噬起正向調(diào)節(jié)作用。抑癌基因P53基因，可通過激活AMPK通路或上調(diào)溶酶體蛋白DRAM對自噬進行正向調(diào)節(jié)。Beclin1則提供平臺作用，使Bcl-2、死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)、UVRAG相關(guān)產(chǎn)物和Vps34等多個蛋白結(jié)合與其結(jié)合形成復合體并整合信息，對自噬進行抑制或活化調(diào)控。其中，Vps34是Ⅲ型PI3K 的一種，與Beclin1結(jié)合而發(fā)揮促進自噬作用，Vps34催化磷脂酰肌醇(PI)生成 PI3P，產(chǎn)生的 PI3P可促進自噬相關(guān)蛋白 Atg 結(jié)合到膜上，形成前自噬結(jié)構(gòu)。Bcl-2是凋亡抑制蛋白，與Beclin1結(jié)合抑制自噬發(fā)生。DAPK與Beclin1結(jié)合正向調(diào)節(jié)自噬。

自噬的調(diào)控信號途徑和凋亡通路相互交錯影響，自噬與凋亡之間的關(guān)系大致有3種：①自噬抑制凋亡，保護細胞；②自噬為凋亡所需，自噬抑制劑可抑制細胞死亡，但凋亡抑制劑不能抑制細胞死亡；③自噬與凋亡共同促進細胞死亡，此時無論抑制自噬或凋亡細胞均轉(zhuǎn)為另一條細胞死亡途徑。凋亡稱為Ⅰ型程序性死亡；過度自噬亦可導致細胞死亡，即自噬性死亡，也稱為Ⅱ型程序性死亡。

2.抗腫瘤藥物誘導自噬

目前，大多數(shù)的抗腫瘤藥物是主要通過誘導凋亡殺死腫瘤細胞。文獻報道，許多抗腫瘤藥物在作用于腫瘤細胞的過程中可誘導自噬發(fā)生[4-7]?？鼓[瘤藥物誘導的自噬影響細胞的存活。有些抗腫瘤藥物誘發(fā)的自噬對腫瘤細胞起保護作用，例如， 氟尿嘧啶作用于人結(jié)腸癌細胞、萊菔硫烷(sulforaphane)作用于前列腺癌細胞、伊馬替尼(imatinib)作用于人惡性膠質(zhì)瘤細胞均可誘導腫瘤細胞發(fā)生保護性自噬，降低腫瘤細胞對藥物的敏感性，甚至耐藥[7-9]。部分抗腫瘤藥物則可直接或間接啟動自噬引起細胞死亡，如三氧化二砷作用于T細胞白血病和骨髓增生異常綜合征細胞株、苯乙基異硫氰酸酯作用于前列腺癌細胞、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)作用于軟骨肉瘤細胞株均可誘導自噬性死亡[10-12]。

抗腫瘤藥物誘導自噬的機制不盡相同，可分別通過抑制mTOR、上調(diào)Beclin1或同時抑制mTOR和上調(diào)Beclin1誘導自噬，誘導過程可涉及不同信號通路[13-17]。

二、紫杉醇誘導腫瘤細胞自噬及發(fā)生機制

紫杉醇于1967年首次從太平洋紅豆杉樹皮中被分離提取，1992年紫杉醇針劑被FDA批準上市后，現(xiàn)已成為卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌的一線化學治療藥物，并且逐漸應用于各種惡性腫瘤的治療。

紫杉醇作用機制至今仍未完全清楚。多數(shù)研究認為，紫杉醇是通過與微管蛋白上三磷酸鳥苷(GTP) 水解位點附近的特異性結(jié)合口袋相結(jié)合，模擬或增強GTP 的作用，促進并穩(wěn)定微管蛋白的聚合, 穩(wěn)定微管，防止其解離，從而導致腫瘤細胞不能形成紡錘體和紡錘絲，染色體斷裂，細胞復制和移行受抑制, 腫瘤細胞阻滯在G2期和M期，分裂和增殖受抑制；紫杉醇可通過多條途徑誘導腫瘤細胞凋亡，包括影響微管穩(wěn)定性而誘發(fā)細胞凋亡、影響信號轉(zhuǎn)導通路直接誘發(fā)細胞凋亡[18]。

近來研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇在誘導凋亡的同時，也可誘導自噬發(fā)生。Xi等[19]報道，紫杉醇在誘導人肺癌A549細胞凋亡時，AO染色的酸性小體增多，LC3、Beclin1、Atg5水平上調(diào)，提示自噬發(fā)生，研究還發(fā)現(xiàn)，紫杉醇可誘導人膠質(zhì)U87瘤細胞、人前列腺癌PC-3細胞以及人結(jié)腸癌細胞HT-29等多個細胞株發(fā)生自噬。此外，紫杉醇在誘導宮頸癌Hela細胞、CaSki細胞、卵巢癌順鉑耐藥細胞SK-OV/DDP、胃癌BGC-823細胞和SGC-7901細胞、人急性T細胞白血病Jurkat細胞、FLCN缺失的腎癌細胞等細胞株死亡過程中，均上調(diào)自噬水平[20-25]。

紫杉醇誘導的自噬可對其誘導細胞死亡產(chǎn)生影響。部分研究發(fā)現(xiàn)，自噬抵抗凋亡，減弱紫杉醇的毒性，對腫瘤細胞起保護作用。Xi等[19]在紫杉醇誘導自噬后，用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)及Beclin1小分子干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染A549細胞抑制自噬，均使紫杉醇對細胞的毒性增加，說明紫杉醇誘導了保護性自噬。紫杉醇在人骨肉瘤細胞株Saos-2細胞、FLCN缺失的腎癌細胞均誘導保護性自噬[13,25]。另有研究報道，紫杉醇誘導的自噬可與凋亡共同促進細胞死亡。Sun等[21]用pc DNA 3.1-Beclin1轉(zhuǎn)染宮頸癌CaSki細胞，上調(diào)Beclin1的表達，結(jié)果自噬率和凋亡率均增加，認為自噬和凋亡起協(xié)同作用。Veldhoen等[26]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇可誘導處于非有絲分裂期的MCF-7細胞生成自噬體，分別用3-MA和ATG7siRNA、VPS34 siRNA抑制自噬，結(jié)果凋亡也同時減少，認為紫杉醇抑制自噬體的運動和成熟，使非有絲分裂期細胞自噬體生成后成熟障礙引發(fā)凋亡。

紫杉醇誘導自噬的機制尚在探索之中。研究認為，微管促使LC3整合到自噬體膜上、促進成熟自噬體從細胞內(nèi)生成部位轉(zhuǎn)移，參與了自噬體的形成、運動以及與溶酶體的融合過程[27-28]。紫杉醇作用于微管，其誘導的自噬是否與微管有關(guān)尚不清楚。Nottle等[29]報道，紫杉醇作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞可誘導mTOR及其下游底物p70s6k的磷酸化減弱，從而誘導自噬。Ajabnoor等[14]用紫杉醇作用于乳腺癌MCF-7細胞誘導產(chǎn)生紫杉醇耐藥株后，發(fā)現(xiàn)耐藥株mTOR及p70s6k的磷酸化減弱。Xi等[19]報道，紫杉醇誘導肺癌A549細胞自噬過程中，Beclin1和Atg5均上調(diào)，以Beclin1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞后，自噬受抑制，此外，紫杉醇誘導人膠質(zhì)U87瘤細胞、人前列腺癌PC-3細胞以及人結(jié)腸癌細胞HT-29等細胞株發(fā)生自噬時，均發(fā)現(xiàn)Beclin1和Atg5上調(diào)，提示紫杉醇通過Beclin1啟動自噬。Tang等[30]報道，紫杉醇作用于人胰腺癌細胞株P(guān)anc02，通過高遷移率族蛋白(HMGB1)與模式識別受體RAGE結(jié)合誘導Beclin1依賴性自噬。Hayashi[31]報道，紫杉醇誘導人主動脈內(nèi)皮細胞自噬可能與P53上調(diào)、Bcl-2和ERK下調(diào)有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇通過Cdx1-Bcl-2-LC3途徑誘導結(jié)腸癌干細胞發(fā)生自噬，通過MAPK途徑誘導FLCN缺失的腎癌細胞自噬[25，32]?？梢姡仙即伎赏ㄟ^多種途徑誘導自噬，誘導的途徑因細胞類型而異。

三、調(diào)整自噬增加紫杉醇敏感性

根據(jù)自噬和抗腫瘤藥物間的關(guān)系，許多研究探索針對自噬進行抗腫瘤治療。針對腫瘤細胞的保護性自噬，可通過抑制自噬增加腫瘤放化學治療敏感性。例如，酪氨酸激酶抑制劑治療慢性骨髓性白血病，常出現(xiàn)耐藥[33]。研究發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼可劑量依賴性地誘導自噬發(fā)生，將伊馬替尼和自噬抑制劑氯喹聯(lián)合作用于慢性骨髄性白血病細胞明顯增加了腫瘤細胞死亡率[34]。又有研究發(fā)現(xiàn)，曲妥珠單抗可誘導HER2陽性的乳腺癌細胞自噬導致細胞耐藥，shRNA抑制LC3表達可增加藥物的敏感性[35]。在膠質(zhì)細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中，都進行了自噬抑制藥物與目前抗腫瘤治療聯(lián)合治療的研究[36]。目前經(jīng)常使用的自噬抑制劑包括：①3-MA，抑制Ⅲ型PI3K 活性；②氯喹、羥氯喹，通過改變?nèi)苊阁w的pH 值抑制自噬小體和溶酶體融合；③巴弗洛霉素A1，通過抑制自噬溶酶體內(nèi)H+-ATPase 的活性，抑制自噬溶酶體的降解；④siRNA，抑制相應Atg 表達。此外，針對細胞過度自噬可導致自噬性死亡的特點，不少研究通過上調(diào)腫瘤細胞自噬活性促進死亡。有報道，替莫唑胺可通過促進自噬殺死有凋亡抗性的惡性膠質(zhì)瘤細胞[37]?？鼓[瘤藥物XK469及其類似物SH80可通過誘發(fā)自噬殺死對多種抗癌藥物耐藥的白血病L1210 細胞，并使細胞生長停滯在G2/M 期[38]。在白血病體內(nèi)試驗中,mTOR特異性抑制劑依維莫司通過誘導過度自噬有效地縮小腫瘤體積[39]。

目前，已有研究探索通過調(diào)整自噬提高腫瘤細胞對紫杉醇的敏感性，改進紫杉醇的臨床療效。有研究發(fā)現(xiàn)，通過抑癌基因ARHI再表達上調(diào)自噬水平可增強紫杉醇對乳腺癌細胞的抑制作用[40]。聯(lián)合應用紫杉醇和自噬抑制劑羥氯喹治療小細胞肺癌正在進行臨床試驗(http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=autophagy)。

四、 結(jié) 語

細胞自噬是在生理條件和病理條件下普遍存在的生理機制，紫杉醇在多個腫瘤細胞株中誘導自噬，其誘導的自噬抑制或促進凋亡，作用機制尚未明確，對其深入研究有望實現(xiàn)通過調(diào)整自噬增加腫瘤細胞對紫杉醇的敏感性。

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