椎間盤退行性變組織工程研究進(jìn)展＊

白亦光 綜述 馮 剛 審校

（川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所，四川 南充 637000）

腰椎間盤退變是引起下腰痛的主要原因之一，其一旦發(fā)生，難以逆轉(zhuǎn)［1，2］。傳統(tǒng)的治療方法如微創(chuàng)［3］、介入［4］等治療只能緩解臨床癥狀，不能從根本上解決問題［5］。近年來，組織工程的出現(xiàn)，特別是髓核和纖維環(huán)組織工程研究的不斷深入及自體椎間盤細(xì)胞移植修復(fù)髓核退變動物實(shí)驗(yàn)的初見成效，為此類疾病的治療帶來了光明的前景。利用組織工程方法修復(fù)退變的椎間盤是具有變革性意義的新的治療探索。組織工程是以細(xì)胞為核心的生物移植工程，其核心內(nèi)容包括：種子細(xì)胞，可供細(xì)胞貼附生長的生物支架或細(xì)胞外基質(zhì)，用以促進(jìn)組織再生的生長因子及基因修復(fù)技術(shù)。組織工程技術(shù)的興起及其在臨床不同領(lǐng)域的應(yīng)用，為椎間盤退變疾病的治療帶來了新的思路。本文就椎間盤退行性變組織工程研究進(jìn)行綜述。

1 種子細(xì)胞

種子細(xì)胞指在組織工程中培養(yǎng)存活增殖最后形成組織的原始細(xì)胞，種子細(xì)胞是體外構(gòu)建工程組織器官最為重要的材料。種子細(xì)胞一般需滿足三個條件：①具有特定的分化表型或定向分化潛能。②容易獲得的細(xì)胞來源及良好的體外擴(kuò)增效率。③在體內(nèi)不引發(fā)免疫排斥反應(yīng)。

1.1 髓核細(xì)胞 髓核組織內(nèi)的細(xì)胞在胚胎時期為脊索細(xì)胞，在正常成年人體內(nèi)主要以類軟骨細(xì)胞為主［6］。髓核細(xì)胞主要表達(dá)蛋白多糖和Ⅱ型膠原，在椎間盤維持脊柱穩(wěn)定記憶承受壓力方面發(fā)揮著重要的作用，但其體外增殖能力較弱，其組織內(nèi)含量也極為有限，培養(yǎng)過程要求非常嚴(yán)格。Gan等［7］發(fā)現(xiàn)，在單層培養(yǎng)時，細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，而球狀培養(yǎng)時，細(xì)胞形態(tài)會發(fā)生部分改變，而體內(nèi)的髓核細(xì)胞也表現(xiàn)為這種特征，細(xì)胞活力強(qiáng)，但細(xì)胞的分裂增殖能力差，可以分泌大量的蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)。他們認(rèn)為髓核細(xì)胞由一維生長環(huán)境培養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)槿S生長的環(huán)境中時會細(xì)胞的特征可以得到部分恢復(fù)，體外的一些形態(tài)學(xué)及免疫組化的鑒定方法可以支持這些結(jié)論，他們認(rèn)為這種特點(diǎn)的細(xì)胞可供椎間盤組織的修復(fù)。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs） 許多動物實(shí)驗(yàn)研究顯示，利用自體MSCs來阻止退變椎問盤的進(jìn)一步發(fā)展或治療已經(jīng)退變的椎間盤，都獲得了非常滿意的治療效果。由于MSCs為體內(nèi)的一種多能分化干細(xì)胞，具有良好的分化特性。所以經(jīng)常被用作組織工程的種子細(xì)胞。Sakai等［8，9］將 MSCs注射植入膠原基質(zhì)中。MSCs可存活超過4周，將MSCs膠原基質(zhì)復(fù)合體植入經(jīng)髓核吸出術(shù)誘導(dǎo)退變的兔椎間盤后。椎間盤內(nèi)蛋白多糖含量明顯增加。Jeong等［10］用8只S－D大鼠尾部椎間盤造模處理后，將人類MSCs移植入大鼠尾部退變的椎間盤，觀察MSCs在大鼠退變的椎間盤模型中的存活情況，結(jié)果顯示，處理組的影像學(xué)表現(xiàn)為高度增加，髓核細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)；而空白組的影像學(xué)顯示髓核結(jié)構(gòu)進(jìn)行性破壞，高度進(jìn)行性降低。上述研究結(jié)果表明，雖然自體 MSCs植入不能完全再生椎間盤，但是它確實(shí)能在某種程度上延緩甚至阻止椎間盤的退變過程。1.3 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs） Ganey等［11］在利用犬自身的脂肪來源的干細(xì)胞修復(fù)受損的椎間盤實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了ADSCs對受損椎間盤的修復(fù)作用。結(jié)果表明，由ADSCs修復(fù)再生的椎間盤治療效果明顯。隨著椎間盤退變病因機(jī)制的認(rèn)識逐漸深入，種子細(xì)胞研究的深入發(fā)展，特別是新型種子細(xì)胞的出現(xiàn)，如近年來的研究熱點(diǎn)——誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPS cells），在未來種子細(xì)胞研究中將占據(jù)非常重要的地位［12］。iPS細(xì)胞是通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒將四種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、c－Myc和Klf4）載入小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，篩選之后，發(fā)現(xiàn)其中具有干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞群落并表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異的表面抗原，且具有多能性、分化性［13］。iPS細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)，為構(gòu)建完整組織工程椎間盤研究和對IDD的細(xì)胞治療帶來了新的希望。

2 細(xì)胞支架

支架材料在組織工程研究中起著替代細(xì)胞外基質(zhì)或組織、器官基質(zhì)的作用，主要功能是為組織或器官體外構(gòu)建提供立體的生長環(huán)境。較為理想的組織工程支架應(yīng)具有如下特點(diǎn)：①良好的組織相容性。②良好的生物聚合性和降解性。③抗原性較低或缺如。④具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)。⑤有良好可塑性和力學(xué)性能［14］。

2.1 殼聚糖 殼聚糖是一種高分子聚合物，其分子結(jié)構(gòu)與軟骨基質(zhì)糖胺多糖相似。殼聚糖在組織工程中具有廣泛應(yīng)用，具有無組織細(xì)胞毒性作用，良好的生物相容性和預(yù)防創(chuàng)傷性軟骨退變等優(yōu)點(diǎn)，其降解產(chǎn)物可作為硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素的合成原料，是軟骨細(xì)胞生長的重要物質(zhì)［15］。

Roughley等［16］將磷酸甘油鈉與殼聚糖混合，制備出包裹細(xì)胞的組織工程支架，研究者在支架上分別培養(yǎng)髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞，結(jié)果表明這種水凝膠支架可以較好地保留髓核細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，也更有利于髓核細(xì)胞的再生，殼聚糖–磷酸甘油混合支架不僅能促進(jìn)髓核細(xì)胞生長，還具有一定的誘導(dǎo)作用，可誘導(dǎo)干細(xì)胞向髓核和軟骨方向分化。Richardson等［17］將間充質(zhì)干細(xì)胞種植到殼聚糖–磷酸甘油支架上，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞存支架上培養(yǎng)4周后，能表達(dá)出髓核和軟骨細(xì)胞的特異性基因SOX－9、COLⅡ和Aggrecan.表明這種支架可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向髓核和軟骨分化。殼聚糖支架的缺陷在于其機(jī)械性能較差，且在生理環(huán)境中降解過快，不能完全滿足組織工程髓核支架的需求。這也限制了殼聚糖支架的進(jìn)一步應(yīng)用。

2.2 藻酸鹽 藻酸鹽具有低毒、組織相容性好、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，可以作為組織工程材料。Iwashina等［18］認(rèn)為，將兔椎間盤細(xì)胞種植于藻酸鹽微球上，在一定強(qiáng)度超聲脈沖干預(yù)下培養(yǎng)增殖，發(fā)現(xiàn)椎間盤細(xì)胞增殖更快且有更多的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。

2.3 膠原 膠原是一種廣泛存在于動物體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)，常被用于制備組織工程支架。端膠原是膠原的一種衍生物，具有溫度敏感性，在4℃以下保持液體狀態(tài)，而在37℃下可以轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。這種溶膠–凝膠的轉(zhuǎn)變使得端膠原可以作為可注射的髓核組織工程支架。Daisuke等［19］以海藻酸鹽支架作為對照組，考察了端膠原作為髓核支架的可行性，結(jié)果表明，在端膠原支架上生長的髓核組織的水溶性較好，能較好地保留髓核分泌的蛋白多糖，從而更有利于髓核組織的再生。

2.4 脂肪族聚酯類 脂肪族聚酯中聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物聚。乳酸聚羥基乙酸共聚物是一類具有生物相容性，塑型簡單，體內(nèi)可降解吸收的合成高分子材料。Sha＇ban等［20］將纖維環(huán)及髓核細(xì)胞種植在纖維蛋白–聚乳酸聚羥基乙酸共聚物支架上獲得良好的培養(yǎng)效果，認(rèn)為此移植物有利于椎間盤退變的修復(fù)。Wan等［21］研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞能在聚合材料上存活，并分泌Ⅱ型膠原及蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)。

3 生長因子

多項(xiàng)研究表明，多種細(xì)胞因子與椎間盤細(xì)胞的分化增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝有關(guān)。將這些細(xì)胞因子應(yīng)用于動物實(shí)驗(yàn)，也表現(xiàn)出良好的作用效果。

3.1 轉(zhuǎn)化生長因子–β（TGF－β） 基于TGF－β與椎間盤退變的關(guān)系，國內(nèi)外許多學(xué)者通過多種途徑探索TGF－β1阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤的退變［22］。他們認(rèn)為TGF－β1是一種較為穩(wěn)定的多功能多肽生長因子，在動物體內(nèi)具有重要的代謝作用，幾乎參與了哺乳動物各種組織細(xì)胞的體內(nèi)代謝過程，并能提高髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)時的細(xì)胞外基質(zhì)的合成及分泌作用［23］。Thompson等［24］也證實(shí)TGF－β1對犬椎間盤細(xì)胞體外細(xì)胞外基質(zhì)的合成及分泌作用，認(rèn)為TGF－β1對于髓核細(xì)胞的作用遠(yuǎn)比對纖維環(huán)細(xì)胞的作用強(qiáng)。

3.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白–7（BMP－7） 骨形態(tài)發(fā)生蛋白–7（bone morphogenefic proteins，BMP–7）由于其對軟骨細(xì)胞纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞合成代謝具有顯著促進(jìn)作用已成為國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)［25］。An等［26］將BMP–7注入兔退變椎間盤，并以生理鹽水作為對照。2周時注射BMP－7的椎間盤高度較生理鹽水對照組高出15%，4周及8周時觀察仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時BMP–7還促進(jìn)了椎間盤內(nèi)蛋白多糖的合成。Imai等［27］使用軟骨素酶ABC對新西蘭兔髓核進(jìn)行化學(xué)溶解，使得處理節(jié)段椎間隙高度下降獲得椎間盤退變動物模型，將重組基因BMP–7注射入退變的椎間盤內(nèi)，2周后發(fā)現(xiàn)處理組髓核組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分，如蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量等以及水分得到了很好的保持，椎間隙高度得到了部分恢復(fù)，并且高度一直維持到第3個月，此實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BMP–7生長因子對于退變椎間盤內(nèi)的髓核有明顯的修復(fù)作用。此外，還有一些生長因子具有調(diào)整細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞基質(zhì)代謝的作用。但需引起注意的是，現(xiàn)有的研究結(jié)果絕大部分來自動物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞培養(yǎng)，除物種差異外，椎間盤細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)椎間盤組織和細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境也有明顯差異。

4 基因技術(shù)

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)基因技術(shù)，可高效、快捷、特異地抑制目的基因的表達(dá)。MeCaffrey等［28］等將針對熒光素酶的siRNA和特異表達(dá)熒光素酶的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染至成年小鼠的肝臟細(xì)胞，觀察到熒光素酶的表達(dá)受到特異的抑制，證實(shí)了RNAi技術(shù)可以動物體內(nèi)產(chǎn)生高效基因沉默效應(yīng)。

Kakutani等［29］在實(shí)驗(yàn)中將雙報(bào)告基因質(zhì)粒（Firefly熒光素酶和Renilla熒光素酶）及針對Firefly熒光素酶的siRNA轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的人和大鼠髓核細(xì)胞。觀察到，在siRNA介導(dǎo)下人和大鼠髓核細(xì)胞中Firefly熒光素酶的基因表達(dá)受到顯著抑制，作用持續(xù)達(dá)兩周，而未見明顯抑制外源性基因Renilla熒光素酶基因表達(dá)。由此證明，RNAi技術(shù)對椎間盤細(xì)胞內(nèi)源性基因具有高效的基因沉默作用。

5 小結(jié)與展望

組織工程技術(shù)為失去功能的退變椎間盤組織的再生提供了可能性。但組織工程在椎間盤領(lǐng)域的研究相對較少，目前仍存在許多包括倫理道德和技術(shù)層面在內(nèi)的問題。我們認(rèn)為，在椎間盤退變疾病的治療領(lǐng)域中，較為有希望的治療策略是：在退變早期或者在椎間盤輕微退變時，采用基因治療以及基于蛋白生長因子的治療方法是有效的；而在中期，采用細(xì)胞治療以及細(xì)胞聯(lián)合基因和生長因子的治療效果可觀，而在椎間盤退變晚期，由于髓核及纖維環(huán)的細(xì)胞凋亡明顯而且功能較差，恢復(fù)可能性小的情況下，我們認(rèn)為采用整體椎間盤移植的方式較為合適。但由于體外整體椎間盤的合成組裝目前并沒有取得突破性進(jìn)展，本實(shí)驗(yàn)室正在致力于這方面的研究，相信不久的將來，我們可以將組織工程技術(shù)用于攻克此類疾病。

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