椎間盤退行性變組織工程研究進(jìn)展＊

白亦光 綜述 馮 剛 審校

（川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所，四川 南充 637000）

腰椎間盤退變是引起下腰痛的主要原因之一，其一旦發(fā)生，難以逆轉(zhuǎn)［1，2］。傳統(tǒng)的治療方法如微創(chuàng)［3］、介入［4］等治療只能緩解臨床癥狀，不能從根本上解決問題［5］。近年來，組織工程的出現(xiàn)，特別是髓核和纖維環(huán)組織工程研究的不斷深入及自體椎間盤細(xì)胞移植修復(fù)髓核退變動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的初見成效，為此類疾病的治療帶來了光明的前景。利用組織工程方法修復(fù)退變的椎間盤是具有變革性意義的新的治療探索。組織工程是以細(xì)胞為核心的生物移植工程，其核心內(nèi)容包括：種子細(xì)胞，可供細(xì)胞貼附生長的生物支架或細(xì)胞外基質(zhì)，用以促進(jìn)組織再生的生長因子及基因修復(fù)技術(shù)。組織工程技術(shù)的興起及其在臨床不同領(lǐng)域的應(yīng)用，為椎間盤退變疾病的治療帶來了新的思路。本文就椎間盤退行性變組織工程研究進(jìn)行綜述。

1 種子細(xì)胞

種子細(xì)胞指在組織工程中培養(yǎng)存活增殖最后形成組織的原始細(xì)胞，種子細(xì)胞是體外構(gòu)建工程組織器官最為重要的材料。種子細(xì)胞一般需滿足三個(gè)條件：①具有特定的分化表型或定向分化潛能。②容易獲得的細(xì)胞來源及良好的體外擴(kuò)增效率。③在體內(nèi)不引發(fā)免疫排斥反應(yīng)。

1.1 髓核細(xì)胞 髓核組織內(nèi)的細(xì)胞在胚胎時(shí)期為脊索細(xì)胞，在正常成年人體內(nèi)主要以類軟骨細(xì)胞為主［6］。髓核細(xì)胞主要表達(dá)蛋白多糖和Ⅱ型膠原，在椎間盤維持脊柱穩(wěn)定記憶承受壓力方面發(fā)揮著重要的作用，但其體外增殖能力較弱，其組織內(nèi)含量也極為有限，培養(yǎng)過程要求非常嚴(yán)格。Gan等［7］發(fā)現(xiàn)，在單層培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，而球狀培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生部分改變，而體內(nèi)的髓核細(xì)胞也表現(xiàn)為這種特征，細(xì)胞活力強(qiáng)，但細(xì)胞的分裂增殖能力差，可以分泌大量的蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)。他們認(rèn)為髓核細(xì)胞由一維生長環(huán)境培養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)槿S生長的環(huán)境中時(shí)會(huì)細(xì)胞的特征可以得到部分恢復(fù)，體外的一些形態(tài)學(xué)及免疫組化的鑒定方法可以支持這些結(jié)論，他們認(rèn)為這種特點(diǎn)的細(xì)胞可供椎間盤組織的修復(fù)。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs） 許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，利用自體MSCs來阻止退變椎問盤的進(jìn)一步發(fā)展或治療已經(jīng)退變的椎間盤，都獲得了非常滿意的治療效果。由于MSCs為體內(nèi)的一種多能分化干細(xì)胞，具有良好的分化特性。所以經(jīng)常被用作組織工程的種子細(xì)胞。Sakai等［8，9］將 MSCs注射植入膠原基質(zhì)中。MSCs可存活超過4周，將MSCs膠原基質(zhì)復(fù)合體植入經(jīng)髓核吸出術(shù)誘導(dǎo)退變的兔椎間盤后。椎間盤內(nèi)蛋白多糖含量明顯增加。Jeong等［10］用8只S－D大鼠尾部椎間盤造模處理后，將人類MSCs移植入大鼠尾部退變的椎間盤，觀察MSCs在大鼠退變的椎間盤模型中的存活情況，結(jié)果顯示，處理組的影像學(xué)表現(xiàn)為高度增加，髓核細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)；而空白組的影像學(xué)顯示髓核結(jié)構(gòu)進(jìn)行性破壞，高度進(jìn)行性降低。上述研究結(jié)果表明，雖然自體 MSCs植入不能完全再生椎間盤，但是它確實(shí)能在某種程度上延緩甚至阻止椎間盤的退變過程。1.3 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs） Ganey等［11］在利用犬自身的脂肪來源的干細(xì)胞修復(fù)受損的椎間盤實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了ADSCs對受損椎間盤的修復(fù)作用。結(jié)果表明，由ADSCs修復(fù)再生的椎間盤治療效果明顯。隨著椎間盤退變病因機(jī)制的認(rèn)識(shí)逐漸深入，種子細(xì)胞研究的深入發(fā)展，特別是新型種子細(xì)胞的出現(xiàn)，如近年來的研究熱點(diǎn)——誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPS cells），在未來種子細(xì)胞研究中將占據(jù)非常重要的地位［12］。iPS細(xì)胞是通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒將四種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、c－Myc和Klf4）載入小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，篩選之后，發(fā)現(xiàn)其中具有干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞群落并表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異的表面抗原，且具有多能性、分化性［13］。iPS細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)，為構(gòu)建完整組織工程椎間盤研究和對IDD的細(xì)胞治療帶來了新的希望。

2 細(xì)胞支架

支架材料在組織工程研究中起著替代細(xì)胞外基質(zhì)或組織、器官基質(zhì)的作用，主要功能是為組織或器官體外構(gòu)建提供立體的生長環(huán)境。較為理想的組織工程支架應(yīng)具有如下特點(diǎn)：①良好的組織相容性。②良好的生物聚合性和降解性。③抗原性較低或缺如。④具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)。⑤有良好可塑性和力學(xué)性能［14］。

2.1 殼聚糖 殼聚糖是一種高分子聚合物，其分子結(jié)構(gòu)與軟骨基質(zhì)糖胺多糖相似。殼聚糖在組織工程中具有廣泛應(yīng)用，具有無組織細(xì)胞毒性作用，良好的生物相容性和預(yù)防創(chuàng)傷性軟骨退變等優(yōu)點(diǎn)，其降解產(chǎn)物可作為硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素的合成原料，是軟骨細(xì)胞生長的重要物質(zhì)［15］。

Roughley等［16］將磷酸甘油鈉與殼聚糖混合，制備出包裹細(xì)胞的組織工程支架，研究者在支架上分別培養(yǎng)髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞，結(jié)果表明這種水凝膠支架可以較好地保留髓核細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，也更有利于髓核細(xì)胞的再生，殼聚糖–磷酸甘油混合支架不僅能促進(jìn)髓核細(xì)胞生長，還具有一定的誘導(dǎo)作用，可誘導(dǎo)干細(xì)胞向髓核和軟骨方向分化。Richardson等［17］將間充質(zhì)干細(xì)胞種植到殼聚糖–磷酸甘油支架上，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞存支架上培養(yǎng)4周后，能表達(dá)出髓核和軟骨細(xì)胞的特異性基因SOX－9、COLⅡ和Aggrecan.表明這種支架可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向髓核和軟骨分化。殼聚糖支架的缺陷在于其機(jī)械性能較差，且在生理環(huán)境中降解過快，不能完全滿足組織工程髓核支架的需求。這也限制了殼聚糖支架的進(jìn)一步應(yīng)用。

2.2 藻酸鹽 藻酸鹽具有低毒、組織相容性好、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，可以作為組織工程材料。Iwashina等［18］認(rèn)為，將兔椎間盤細(xì)胞種植于藻酸鹽微球上，在一定強(qiáng)度超聲脈沖干預(yù)下培養(yǎng)增殖，發(fā)現(xiàn)椎間盤細(xì)胞增殖更快且有更多的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。

2.3 膠原 膠原是一種廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)，常被用于制備組織工程支架。端膠原是膠原的一種衍生物，具有溫度敏感性，在4℃以下保持液體狀態(tài)，而在37℃下可以轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。這種溶膠–凝膠的轉(zhuǎn)變使得端膠原可以作為可注射的髓核組織工程支架。Daisuke等［19］以海藻酸鹽支架作為對照組，考察了端膠原作為髓核支架的可行性，結(jié)果表明，在端膠原支架上生長的髓核組織的水溶性較好，能較好地保留髓核分泌的蛋白多糖，從而更有利于髓核組織的再生。

2.4 脂肪族聚酯類 脂肪族聚酯中聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物聚。乳酸聚羥基乙酸共聚物是一類具有生物相容性，塑型簡單，體內(nèi)可降解吸收的合成高分子材料。Sha＇ban等［20］將纖維環(huán)及髓核細(xì)胞種植在纖維蛋白–聚乳酸聚羥基乙酸共聚物支架上獲得良好的培養(yǎng)效果，認(rèn)為此移植物有利于椎間盤退變的修復(fù)。Wan等［21］研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞能在聚合材料上存活，并分泌Ⅱ型膠原及蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)。

3 生長因子

多項(xiàng)研究表明，多種細(xì)胞因子與椎間盤細(xì)胞的分化增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝有關(guān)。將這些細(xì)胞因子應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，也表現(xiàn)出良好的作用效果。

3.1 轉(zhuǎn)化生長因子–β（TGF－β） 基于TGF－β與椎間盤退變的關(guān)系，國內(nèi)外許多學(xué)者通過多種途徑探索TGF－β1阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤的退變［22］。他們認(rèn)為TGF－β1是一種較為穩(wěn)定的多功能多肽生長因子，在動(dòng)物體內(nèi)具有重要的代謝作用，幾乎參與了哺乳動(dòng)物各種組織細(xì)胞的體內(nèi)代謝過程，并能提高髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞外基質(zhì)的合成及分泌作用［23］。Thompson等［24］也證實(shí)TGF－β1對犬椎間盤細(xì)胞體外細(xì)胞外基質(zhì)的合成及分泌作用，認(rèn)為TGF－β1對于髓核細(xì)胞的作用遠(yuǎn)比對纖維環(huán)細(xì)胞的作用強(qiáng)。

3.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白–7（BMP－7） 骨形態(tài)發(fā)生蛋白–7（bone morphogenefic proteins，BMP–7）由于其對軟骨細(xì)胞纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞合成代謝具有顯著促進(jìn)作用已成為國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)［25］。An等［26］將BMP–7注入兔退變椎間盤，并以生理鹽水作為對照。2周時(shí)注射BMP－7的椎間盤高度較生理鹽水對照組高出15%，4周及8周時(shí)觀察仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)BMP–7還促進(jìn)了椎間盤內(nèi)蛋白多糖的合成。Imai等［27］使用軟骨素酶ABC對新西蘭兔髓核進(jìn)行化學(xué)溶解，使得處理節(jié)段椎間隙高度下降獲得椎間盤退變動(dòng)物模型，將重組基因BMP–7注射入退變的椎間盤內(nèi)，2周后發(fā)現(xiàn)處理組髓核組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分，如蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量等以及水分得到了很好的保持，椎間隙高度得到了部分恢復(fù)，并且高度一直維持到第3個(gè)月，此實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BMP–7生長因子對于退變椎間盤內(nèi)的髓核有明顯的修復(fù)作用。此外，還有一些生長因子具有調(diào)整細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞基質(zhì)代謝的作用。但需引起注意的是，現(xiàn)有的研究結(jié)果絕大部分來自動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞培養(yǎng)，除物種差異外，椎間盤細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)椎間盤組織和細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境也有明顯差異。

4 基因技術(shù)

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)基因技術(shù)，可高效、快捷、特異地抑制目的基因的表達(dá)。MeCaffrey等［28］等將針對熒光素酶的siRNA和特異表達(dá)熒光素酶的質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染至成年小鼠的肝臟細(xì)胞，觀察到熒光素酶的表達(dá)受到特異的抑制，證實(shí)了RNAi技術(shù)可以動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生高效基因沉默效應(yīng)。

Kakutani等［29］在實(shí)驗(yàn)中將雙報(bào)告基因質(zhì)粒（Firefly熒光素酶和Renilla熒光素酶）及針對Firefly熒光素酶的siRNA轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的人和大鼠髓核細(xì)胞。觀察到，在siRNA介導(dǎo)下人和大鼠髓核細(xì)胞中Firefly熒光素酶的基因表達(dá)受到顯著抑制，作用持續(xù)達(dá)兩周，而未見明顯抑制外源性基因Renilla熒光素酶基因表達(dá)。由此證明，RNAi技術(shù)對椎間盤細(xì)胞內(nèi)源性基因具有高效的基因沉默作用。

5 小結(jié)與展望

組織工程技術(shù)為失去功能的退變椎間盤組織的再生提供了可能性。但組織工程在椎間盤領(lǐng)域的研究相對較少，目前仍存在許多包括倫理道德和技術(shù)層面在內(nèi)的問題。我們認(rèn)為，在椎間盤退變疾病的治療領(lǐng)域中，較為有希望的治療策略是：在退變早期或者在椎間盤輕微退變時(shí)，采用基因治療以及基于蛋白生長因子的治療方法是有效的；而在中期，采用細(xì)胞治療以及細(xì)胞聯(lián)合基因和生長因子的治療效果可觀，而在椎間盤退變晚期，由于髓核及纖維環(huán)的細(xì)胞凋亡明顯而且功能較差，恢復(fù)可能性小的情況下，我們認(rèn)為采用整體椎間盤移植的方式較為合適。但由于體外整體椎間盤的合成組裝目前并沒有取得突破性進(jìn)展，本實(shí)驗(yàn)室正在致力于這方面的研究，相信不久的將來，我們可以將組織工程技術(shù)用于攻克此類疾病。

［1］劉 康，白亦光，馮 剛.生長分化因子5誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究［J］.西部醫(yī)學(xué)，2013（25）：1128－1131.

［2］白亦光，劉 康，馮 剛.兔髓核細(xì)胞原代培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.西部醫(yī)學(xué)，2013（25）：1136－1139.

［3］劉 康，白亦光，陳 竹，等.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011（02）：103－106.

［4］白亦光，韓小偉，張旭乾，等.穿刺抽吸法誘導(dǎo)兔椎間盤退變模型［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013（28）：91－94.

［5］Aguiar DJ，Johnson SL，Oegema TR.Notochordal cells interact with nucleus pulposus cells：regulation of proteglycan synthesis［J］.Exp Cell Res，1999，246－137.

［6］Gruber HE，F(xiàn)isher EC Jr，Desai B，et al.Human interverbral disc cells from the annulus：three－dimensional cuture in agarose or alginate and responsiveness to TGF－betal［J］.Exp Cell Res，1997，235：13－21.

［7］Gan JC，Ducheyne P，Vresilowic EJ，et al.Interverbral disc tissue engineeringⅡ：cultures of nucleus puplposus［J］.Clin Orthop Relat Res，2003，411：315－314.

［8］Sakai D，Mochida J，Yamamoto Y，et al.Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc：apotential therapeutic model for disc degeneration［J］.Biomaterials，2003，24（20）：3531－3541.

［9］Sakai D，Mochida J，Iwashina T，et al.Regenerative effects of transplanting mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen to the degenerated intervertebral disc［J］.Biomaterials，2006，27（3）：335－345.

［10］Jeong JH，Jin ES，Min JK，et al.Human mesenchymal stem cells implantation into the degenerated coccygeal disc of the rat［J］.J Cytotechnology，2009，59（1）：55－64.

［11］Ganey T，Hutton WC，Moseley T，et al.Intervertebral disc repair using adipose tissue－derived stem and regenerative cells：experiments in a canine model［J］.J Spine，2009，34（21）：2297－2304.

［12］Illich DJ，Demir N，Stojkovic M，et al.Induced Pluripotent Stem（Ips）Cells and Lineage Reprogramming：Prospects for Bone Regeneration［J］.J Stem Cells，2011，29（4）：555－563

［13］Takahashi K，yamanaka S.Induction of pluripotent Stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.J Cell，2006，126（4）：663－676.

［14］Kandel R，Roberts S，Urban JP.Tissue engineering and the intervertebral disc：the challenges［J］.Eur Spine J，2008，17（Suppl4）：480－491.

［15］楊澤龍，馮 剛.椎間盤組織工程學(xué)髓核種子細(xì)胞的研究新進(jìn)展［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013（28）：107－111.

［16］Roughley P，Hoemann C，DesRosiers E.The potential of chitosan－based gels containing intervertebral disc cells for nucleus pulposus spplementation［J］.Biomaterials，2006，27（3）：388－396.

［17］Richardson SM，Hughes N，Hunt JA.Human mesenchymal stem cell differentiation to NP－like cells in chitosan－glycerophos－phate hydrogels［J］.Biomaterials，2008，29（1）：85－93.

［18］Iwashina T，Mochida J，Miyazaki T，et al.Low－intensity pulsed ultrasound stimulates cell proliferation and proteoglycan production in rabbit intervertebral disc cells cultured in alginate［J］.Biomaterials，2006，27（3）：354－361.

［19］Daisuke S，Jo JM，Tom I.Atelocollagen for culture of human nucleus pulposus cells forming nucleus pulposus－like tissue in vitro：insuence on the proliferation and proteoglycan production of HNPSV－1cells［J］.Biomaterials，2006，27（3）：346－353.

［20］Sha＇ban M，Yoon SJ，Ko YK，et al.Fibrin promotes proliferation and matrix production of intervertebral disc cells cultured in three－dimensional poly（lactic－co－glycolic acid）scaffold［J］.J Biomater Sci Polym Ed，2008，19（9）：1219－1237.

［21］Wan YQ，F(xiàn)eng G，Shen FH，et al.Biphasic scaffold for annulus fibrosus tissue regeneration［J］.Biomaterials，2008，29：643－652.

［22］Denaro V，Vadala G，Kang JD.Gene therapy for intervertebral disc degenration：efficiacy and improved safety［J］.Bone and Joint Surgery，2009，91（1）：272－2751.

［23］Gruber HE，Norton HJ，Hanley EN Jr.Anti－apoptotic effects of IGF－I and PDGF on human intervertebral disc cells in vitro［J］.J Spine，2000，25（17）：2153－2157.

［24］Thompson JP，Oegema TR，Bradford DS.Stimulation of mature canine intervertebral disc by growth factors［J］.J Spine，1991，16（3）：253－260.

［25］Wozney JM，Rosen V，Celeste AJ，et al.Novel regulators of bone formation：molecular clones and activities ［J］.Science，1988，242（4885）：1528－1534.

［26］An HS，Takegami K，Kamada H，et al.Intradiscal administration of osteogenic protein－1increase interverbral disc height and proteglycan content in the nucleus pulposus in normal adolescent rabbits［J］.Spine，2005，30（1）：25－32.

［27］Imai Y，Okuma M，An HS，et al.Restoration of disc height loss by recombinant human osteogenic proten－1injection into intervertebral discs undergoing degeneration induced by an intradiscal injection of chondroitinase ABC［J］.Spine，2007，32（11）：1197－1205.

［28］MeCaffrey AP，Meuse L，Pham IT，et al.RNAinterference in adult mice［J］.Nature，2002，418（6893）：38－39.

［29］Kakutani K，Nishida K，Uno K，et al.Prolongeddown regulation of specific gene expression in nucleus pulposus cell mediated by RNAinterference invitro［J］.Orthop Res，2006，24（6）：1271－1278.