葡激酶研究進展

茍冶然 綜述 周建中 審校

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400016)

葡激酶(staphylokinase，SAK)是一種具有極大臨床應用前景的新型溶栓制劑，不僅具有高效的纖溶活性及對纖維蛋白特異的識別作用，而且在溶栓過程中血纖維蛋白原降解少，不會引起全身纖溶亢進。但作為一種葡萄球菌來源的異體蛋白，進入機體后容易誘發(fā)免疫反應，尤其是重復使用時其誘導的中和抗體對療效(溶栓效果)有很大影響，從而限制了其在日常的預防和恢復治療的應用。隨著生物醫(yī)學工程技術(shù)的發(fā)展，通過分子生物學技術(shù)使葡激酶基因重組從而降低其免疫原性成為目前研究的熱點?，F(xiàn)就葡激酶的分子結(jié)構(gòu)特點、溶栓活性、機理及免疫原性改造等方面的研究進展做一系統(tǒng)綜述。

1 葡激酶的分子結(jié)構(gòu)

天然葡激酶是金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合成的一種胞外蛋白質(zhì)。Sako 等［1-2］從金黃色葡萄球菌ΦC 基因組克隆出SAK 基因并確定了其序列。成熟的SAK 是由136 個氨基酸殘基組成的無二硫鍵連接的單鏈多肽結(jié)構(gòu)，相對分子量為15.5 kD(≈1.55 ×104)，主要為疏水氨基酸，其中包括45 個帶電氨基酸殘基，不含胱氨酸及糖基，決定活性的氨基酸主要位于親水一側(cè)。通過對SAK 晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，葡激酶分子空間構(gòu)象呈一緊湊的橢球體，僅包含一個結(jié)構(gòu)域——即由5 個β 折疊堆積于由12 個殘基構(gòu)成的α螺旋上形成的致密體［3］，當α 螺旋結(jié)構(gòu)反向平行時可結(jié)合在一起促使SAK 單體形成二聚體［4］。研究發(fā)現(xiàn)，SAK 分子N-端前16 位氨基酸是位于α 螺旋與β 折疊所形成的致密體之外的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其中第11～16 位帶正電的Lys 殘基對結(jié)合及活化纖溶酶原有重要作用［5］。此外，序列中第20～77 位氨基酸形成的絲氨酸蛋白酶功能區(qū)域可能與葡激酶N-端融合蛋白的自動裂解有關［6］。

2 葡激酶的溶栓特點

葡激酶最早于1948 年被Lack 發(fā)現(xiàn)并證實具有纖溶酶原激活作用。近年來隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，葡激酶及各種衍生物成功在大腸桿菌中高效表達。大量實驗結(jié)果證實通過原核表達體系獲得的SAK 具有生產(chǎn)成本低，纖溶能力及血管再通率與內(nèi)生組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)相當，優(yōu)于尿激酶(urokinase，UK)，且具有更高的纖維蛋白專一性等優(yōu)點［7］。這可能與其獨特的溶栓機理有關。

葡激酶本身沒有蛋白酶活性，是一種“間接型”的纖溶酶原激活劑，與t-PA、UK 等不同，不能直接作用于纖溶酶原Arg561-Val562 位肽健促使纖溶酶原(plasminogen，Plg)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(plasmin，Plm)，而是作為一種輔助因子，以1∶1 的比例結(jié)合到纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶區(qū)，在血栓表面痕量纖溶酶的作用下切斷纖溶酶原的Arg561-Val562，暴露出活性位點［8］。該過程中葡激酶的空間構(gòu)象也相應發(fā)生改變，Lys10-Lys11 被選擇性切斷，40～46 位氨基酸殘基更加暴露，促進葡激酶與纖溶酶緊密結(jié)合［9］。葡激酶-纖溶酶復合物是高效的纖溶酶原激活劑，激活游離的纖溶酶原形成纖溶酶，纖溶酶上的賴氨酸結(jié)合位點與血栓中的纖維蛋白結(jié)合，催化纖維蛋白降解，從而溶解血栓，恢復血液循環(huán)，同時纖溶酶還可以溶解一些凝血因子。

血漿中，α2-抗纖溶酶可競爭性結(jié)合到葡激酶-纖溶酶復合物中的賴氨酸結(jié)合位點從而抑制其溶栓活性。其抑制作用呈劑量相關性，當復合物中Lys 結(jié)合位點被纖維蛋白占據(jù)后，α2-抗纖溶酶的抑制率會下降100 倍［10］。有效的纖溶酶原活化作用僅發(fā)生在血纖維蛋白表面，是因為完整的血小板表面能為溶解纖維蛋白提供催化場所。如果沒有纖維蛋白存在，復合物很快被α2-抗纖溶酶中和，然后被巨噬細胞吞噬，避免溶血形成。研究發(fā)現(xiàn)，SAK 肽鏈11 位上的賴氨酸和26 位上的甲硫氨酸殘基是激活纖溶酶原的重要部位，若將其水解或替換為其他氨基酸，SAK 將失去活性［11］。同時，有報道發(fā)現(xiàn)磷酸丙糖異構(gòu)酶也會引起SAK 的纖溶酶原激活作用大大降低［12］。

3 葡激酶免疫原性的研究

葡激酶是一種極具研發(fā)潛力的溶栓制劑，具有如下一些優(yōu)點:(1)分子量小、穿透性能好、溶栓活性高;(2)葡激酶進入體內(nèi)后迅速被肌肉和腎臟攝取，不分布于肝臟，不會引起纖溶酶原的明顯降解;(3)高度纖維蛋白特異性，不會引起全身纖溶亢進，溶栓后出血并發(fā)癥少;(4)高血栓選擇性，對陳舊性血栓和富含血小板的血栓，尤其是腦動脈血栓和肢體動靜脈血栓的溶解作用突出;(5)在原核及真核系統(tǒng)中均能表達，易大量制備，不含二硫鍵，易復性。但葡激酶作為一種異體蛋白，作用于人體有較強的抗原性，且血漿半衰期短，僅持續(xù)3 min 左右。雖然臨床試驗中還未發(fā)現(xiàn)嚴重的過敏反應，然而80%以上的患者用藥后2 周，機體會產(chǎn)生高滴度的IgG 中和抗體，且抗體水平可以維持半個月到1 年左右，嚴重影響了葡激酶的重復使用。為了降低葡激酶的免疫原性，使之更加適合臨床應用，國內(nèi)外多個課題組通過定點突變、化學修飾及構(gòu)建融合蛋白等方法對葡激酶進行結(jié)構(gòu)改造研究，并且取得了一些成果。

3.1 表位研究與定點突變

抗原性取決于蛋白質(zhì)分子表面由15～22 個氨基酸殘基組成的抗原決定簇。近兩年的研究很大一部分集中于對葡激酶分子抗原決定簇的確定及改造，以期把葡激酶改造成為低免疫原性的高效溶栓制劑。

組成一個抗原決定簇的氨基酸在空間構(gòu)象上相鄰，而在一級結(jié)構(gòu)中往往不連續(xù)，且通常只有幾個氨基酸決定與抗體結(jié)合的活性。通過競爭性抗體的特異性結(jié)合反應及噬菌體展示抗原突變庫的負選技術(shù)發(fā)現(xiàn)［13］，葡激酶分子中存在3 個互不重疊的B 細胞抗原決定表位，其中抗原表位1 由第74，75，77 位氨基酸殘基構(gòu)成，抗原表位3 由第35，38，80，82 位氨基酸殘基構(gòu)成，抗原表位2 的氨基酸殘基還有待進一步確定，推測與二聚體的形成有關。

Warmerdam 等［14］通過分析大量不同來源的葡激酶特異性T 細胞表位發(fā)現(xiàn)，葡激酶分子內(nèi)存在6 個不同的T 細胞抗原決定區(qū)域，其中C3 區(qū)(71～87 位氨基酸)是B 細胞抗原表位和T 細胞抗原表位非常集中的區(qū)域，可被90%病人特異性T 細胞識別。進一步研究發(fā)現(xiàn)C3 區(qū)包含S1(72～82)和S2(75～85)兩個重疊的T 細胞表位序列，其中73，76 位氨基酸分別為兩個表位的關鍵氨基酸，若將C3 區(qū)的氨基酸序列替代突變?yōu)楸彼岷螅霞っ竿蛔凅w仍保留溶栓活性，但對C3 特異性T 細胞克隆無反應。Xu 等［15］通過定點突變掉葡激酶的T 細胞和B 細胞抗原表位重疊的關鍵氨基酸Arg77 和Glu80，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該突變體免疫原性明顯降低，而其纖溶活性和催化效率則與r-葡激酶相當?？乖砦坏陌l(fā)現(xiàn)，可能為葡激酶免疫原性的進一步改造提供新的思路。

3.2 葡激酶結(jié)構(gòu)改造

目前，葡激酶結(jié)構(gòu)改造多以其空間結(jié)構(gòu)與生物學功能的關系為基礎，通過分子設計及其指導的特定的基因修飾，從而實現(xiàn)對天然葡激酶的定向改造。

3.2.1 葡激酶的化學修飾

3.2.1.1 葡激酶的聚乙二醇修飾

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一種巰基特異性修飾劑，是一種無毒、無免疫原性的水溶性高分子物質(zhì)，可以通過化學反應與蛋白質(zhì)的非必須基團共價結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)［16］，將葡激酶的特異性氨基酸定點突變?yōu)榘腚装彼岷笤俳?jīng)PEG 修飾，不僅能延長藥物在血液中的循環(huán)半衰期，并通過遮蔽抗原決定簇來降低蛋白的免疫原性，且一般不會影響蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和生物活性，從而提高葡激酶的療效，減少毒副作用，為臨床應用帶來了方便。此外，PEG 修飾可以使葡激酶分子量大大增加，增強其水溶性，增強抵抗蛋白酶水解的能力，并且降低腎臟對蛋白質(zhì)的排泄作用［17］。

但是，PEG 化修飾葡激酶降低免疫原性的同時，不可避免的會通過空間位阻的作用部分遮蔽葡激酶活性位點，影響其對纖溶酶原的結(jié)合及活化作用，目前的研究多集中在通過減小PEG 的分子量或者構(gòu)建葡激酶二聚體(PEG-dSAK)來降低PEG 化對溶栓活性的影響［18］。

3.2.1.2 葡激酶的聚乙烯醇修飾

聚乙烯醇(polyving akohol，PVA)作為添加劑，能夠防止溶菌酶在水/二氯甲烷面的變性，是一種被廣泛運用于醫(yī)藥和食品工業(yè)的水溶性高分子聚合物。王改珍等［19］對PVA 與葡激酶形成的復合物中葡激酶酰胺I 帶定量分析發(fā)現(xiàn)，葡激酶分子中易導致蛋白變性的分子間折疊明顯減少，有利于增強葡激酶蛋白的穩(wěn)定性。

3.2.2 葡激酶的靶向性改造

生物靶向技術(shù)主要是通過受體與配體的特異性結(jié)合而發(fā)揮靶向定位作用，廣泛運用于腫瘤治療的靶向給藥。近年來，為提高溶栓效果，防止再栓塞，靶向溶栓劑的研究引人注目。纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)和活化血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa 受體的特異性結(jié)合是生理性誘導血小板聚集的最終共同通道，在血栓形成中起著重要作用。含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的物質(zhì)均可競爭性地抑制Fg 和GPⅡb/Ⅲa 受體的結(jié)合，且具有對血栓部位血小板的趨向性，可以最直接、最完全地抑制活化血小板聚集，從而抑制血栓的形成。

RGD 序列有線狀和含二硫鍵的環(huán)狀兩種結(jié)構(gòu)，其中環(huán)狀RGD 序列比線性序列有著更強的GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合力和受體特異性，因此含RGD 序列藥物的研發(fā)都是基于環(huán)狀RGD 序列［20］。Ning 等［21］通過特異性位點突變，將構(gòu)建的低免疫原性葡激酶突變體mSAK(K130T、K135R)的35，36，37 位的氨基酸分別替換為R、G、D，得到了RGD-m 葡激酶(K130T、K135R)，不僅溶栓活性與野生型葡激酶相當，而且還具有良好的抗血小板聚集效應和低免疫原性。蘇曉明等［22］構(gòu)建的RGDS-葡激酶納米脂質(zhì)體及Jingfang等［23］構(gòu)建的葡激酶突變體MD2-葡激酶、MD4-葡激酶，均得到了類似的結(jié)論。推測突變體的抗血小板功能跟RGD 短肽序列能與Fg 競爭結(jié)合GPⅡb/Ⅲa 受體，其羧基端的10 余個氨基酸是特異性結(jié)合并使凝血酶失活的關鍵區(qū)域，能使相鄰血小板之間失去了相互交聯(lián)的“橫橋”，從而阻止血小板的聚集有關。

臨床試驗表明使用重組葡激酶后仍有一定的再梗塞率，其中血小板介導的動脈血栓的形成是溶栓后再梗塞的主要原因，將RGD 序列導入溶栓藥物，所得的突變體具有溶栓、防栓的雙重功能［24］。

3.2.3 葡激酶融合蛋白的構(gòu)建

融合蛋白是指通過DNA 重組技術(shù)使兩個基因片段連接后的表達產(chǎn)物。研究證實［25］，利用基因融合構(gòu)建的融合蛋白一般均保留所構(gòu)成的酶分子各自的酶活性。因此，通過在葡激酶中融合其他功能的蛋白來提高葡激酶的溶栓活性及特異性，成為近年研究的熱點。

徐東崗等［26］通過基因工程方法構(gòu)建的葡激酶與P11 融合基因的表達產(chǎn)物，溶栓活性高，免疫原性低，加上半衰期延長，不僅可以提高藥物的療效，還可以降低藥物成本和價格。其中，P11 又稱為S100A10，廣泛存在于人體內(nèi)，通常作為膜聯(lián)蛋白annexin11 異四聚體復合物的亞基調(diào)節(jié)血液纖溶系統(tǒng)，刺激組織型纖溶酶原激活因子。

Szemraj 等［27］通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了一種新的葡激酶融合蛋白，葡激酶-RGD-K2-Hirul。該融合蛋白包括4 個部分:(1)葡激酶，高效溶栓作用;(2)RGD，抗血小板聚集;(3)K2，tPA 分子與纖維蛋白結(jié)合部位;(4)hirul，水蛭素的C 末端，天然抗凝小分子蛋白。在頸動脈血栓動物模型中，該融合蛋白在溶解血栓、開通閉塞血管方面明顯強于野生型葡激酶，抗凝血酶的作用與水蛭素相當并明顯延長了激活的部分促凝血酶原時間(APTT)和凝血酶時間(PT)。Pulicherla等［28］構(gòu)建的融合蛋白葡激酶-RGD-Hirulog(SRH)，成功在大腸桿菌GJ1158 中誘導表達，純化后的蛋白通過驗證也得到了類似的結(jié)論。

融合蛋白的構(gòu)建已在葡激酶的結(jié)構(gòu)改造中顯示出一定的優(yōu)勢，新的融合蛋白多能在保存天然葡激酶溶栓活性的基礎上增加抗凝、抗血小板聚集、防止血管再堵塞等功能。為葡激酶改造提供了新的研發(fā)方向。

4 展望

血栓性疾病是全球病死率和發(fā)病率均較高的疾病之一，特別是急性心肌梗死、腦血栓、肺靜脈栓塞等。血栓性疾病嚴重危害人類健康，每年都有數(shù)百萬的人死于該疾病。血栓的形成減少或阻斷了重要臟器的血供，導致組織局部缺氧、細胞壞死以及臟器功能的喪失。溶栓治療因其方便、快捷、易于在基層醫(yī)院開展等優(yōu)勢而逐漸成為血栓性疾病的主要治療手段。葡激酶以其高效的纖溶活性、特異的纖維蛋白選擇性得到了廣泛的關注和研究，但天然葡激酶進入體內(nèi)后誘發(fā)的免疫反應限制了其在臨床的應用。隨著葡激酶晶體結(jié)構(gòu)的解析，人們得以進一步分析其免疫原性與結(jié)構(gòu)的關系，進而應用生物工程技術(shù)對結(jié)構(gòu)進行改造，期望能夠在不影響其溶栓活性的前提下盡可能降低免疫原性。相信隨著人們對葡激酶免疫原性產(chǎn)生機制認識的深入，一種低免疫原性的高效特異性溶栓劑——新型葡激酶突變體能夠在不久的將來為血栓性疾病患者帶來福音。

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