玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的條件優(yōu)化研究

謝慧，張兆昆，吳瓊，王風(fēng)芹，任天寶，宋安東*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州450002）

玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的條件優(yōu)化研究

謝慧1，張兆昆1，吳瓊1，王風(fēng)芹1，任天寶2，宋安東1*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州450002）

以玉米秸稈水解液為原料，對一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）ATCC 55618的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，研究了培養(yǎng)溫度、發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH以及培養(yǎng)基成分對該菌株產(chǎn)琥珀酸發(fā)酵的影響，并利用響應(yīng)面法（RSM）對發(fā)酵培養(yǎng)基中的水解糖、玉米漿和Na2CO3添加量3個主要因素進行優(yōu)化，經(jīng)過優(yōu)化后的發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)基初始pH6.8；水解糖質(zhì)量濃度60g/L、玉米漿質(zhì)量濃度10g/L、Na2CO3（10mol/L）添加量2mL。在1L的厭氧甁中進行了分批發(fā)酵放大實驗，琥珀酸產(chǎn)量最高達19.66g/L。

玉米秸稈；水解液；琥珀酸；條件優(yōu)化；響應(yīng)面法

琥珀酸學(xué)名丁二酸，是一種廣泛存在于人體、動植物和微生物體內(nèi)常見的天然有機酸。琥珀酸是三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）的中間產(chǎn)物之一，在生物的代謝中占有非常重要的地位，因此被廣泛用于化學(xué)藥物的中間體[1]。琥珀酸也被公認(rèn)為將是繼檸檬酸和乳酸后的下一個大規(guī)模生產(chǎn)的有機酸產(chǎn)品[2]。傳統(tǒng)的琥珀酸生產(chǎn)方法主要是依賴化石原料通過化學(xué)過程來合成琥珀酸。然而，隨著能源危機的日益嚴(yán)重，新興的發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸以其低能耗、高環(huán)保性和原料的可持續(xù)利用性而受到越來越多科學(xué)家的重視。

我國擁有豐富的植物纖維資源（如農(nóng)作物秸稈、林產(chǎn)品加工業(yè)下腳料等），每年僅玉米秸稈一項就超過1.7億t[3]。每年浪費或低利用的纖維材料總共約10億t，其中農(nóng)作物秸稈一項大約7億t[4]，這些纖維質(zhì)原料（如玉米秸稈、玉米籽皮、玉米芯等）可以利用物理或化學(xué)的預(yù)處理方法破壞纖維質(zhì)原料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)降低其聚合度；再加入水解酶或能產(chǎn)生水解酶的微生物使纖維質(zhì)原料轉(zhuǎn)化為低分子糖類如葡萄糖和木糖等，最后利用微生物發(fā)酵大規(guī)模的轉(zhuǎn)化制備琥珀酸等生物基化工產(chǎn)品，產(chǎn)業(yè)前景十分廣闊[5]。因此，利用農(nóng)作物秸稈水解液作碳源制備琥珀酸，將有效減少琥珀酸發(fā)酵對淀粉原料的依賴性，緩解當(dāng)前面臨的糧食危機問題，并可降低原料成本[6]。

目前，琥珀酸發(fā)酵的研究主要集中在菌種選育和代謝調(diào)控等方面。關(guān)于琥珀酸發(fā)酵條件優(yōu)化方面的研究較少，尤其是以纖維水解液為原料發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的條件研究則更少，因此，本研究也為實現(xiàn)以農(nóng)作物秸稈水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)業(yè)化提供一定的參考條件和技術(shù)支撐。文中研究利用水解糖質(zhì)量濃度為39.99g/L（葡萄糖質(zhì)量濃度為19.07g/L、木糖質(zhì)量濃度為20.82g/L）的玉米秸稈水解液作原料，在300mL厭氧甁中對一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）ATCC 55618首先進行了培養(yǎng)溫度、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值及發(fā)酵培養(yǎng)及成分的條件優(yōu)化；為進一步提高琥珀酸產(chǎn)量，又利用響應(yīng)面法優(yōu)化琥珀酸發(fā)酵培養(yǎng)基中的3個主要因素；并利用優(yōu)化后的發(fā)酵條件在1L的厭氧甁中進行分批發(fā)酵放大試驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

玉米秸稈：取自河南省新鄉(xiāng)，粉碎至10目，經(jīng)檢測其成分為纖維素32.56%，半纖維素20.64%，木質(zhì)素11.95%，水分4.41%，灰分3.22%[17]。

1.1.2 試劑

纖維素酶（濾紙酶活260U/mL）和木聚糖酶（10 000U/mL）：杰能科（中國）生物工程有限公司；酵母膏、玉米漿均為工業(yè)級；發(fā)酵試驗所用的試劑均為市售色譜純或分析純。

1.1.3 菌種

菌種：產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（A.succinogenes），保存號ATCC 55618，購自中國工業(yè)菌種保藏中心（CICC）。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2.5g、K2HPO4·3H2O 2.5g、胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、NaCl 5g、pH 7.0加水定容至1L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米秸稈水解液（水解糖質(zhì)量濃度為40g/L）、玉米漿15g/L、富馬酸二鈉1g/L、K2HPO43g/L、NaCl 1g/L、MgCl20.2g/L、CaCl20.2g/L、NaH2PO4·H2O 1.6g/L、Na2HPO40.31g/L[6]。

1.2 儀器與設(shè)備

JYS-1000全自動高壓蒸氣滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；722S可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；P680 HPLC高效液相色譜儀：美國戴安公司；Aminex HPX-87H色譜柱：美國Bio-Red公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將處于生長對數(shù)期的種子液以5%的接種量在厭氧條件下接入裝有90mL培養(yǎng)基的300mL厭氧甁中，再充入250mLCO2（純度99.99%）氣體，并用封口膜密封保證厭氧環(huán)境，置于37℃搖床中150r/min培養(yǎng)。

1.3.2 檢測方法

發(fā)酵液在室溫條件下10 000r/min離心10min，取上清，用孔徑為0.22μm的無菌濾膜過濾。利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測發(fā)酵底物與產(chǎn)物含量，色譜柱為HPX-87H（美國Bio-Red公司），流動相為5mmol/L的H2SO4溶液，流速為0.6mL/min，柱溫55℃，進樣量10μL，檢測器為視差折光（refractive index，RI）檢測器。菌體密度利用可見分光光度計于波長660nm處測定其吸光度值。結(jié)果均為平行測定3次后的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化

2.1.1 培養(yǎng)溫度對琥珀酸發(fā)酵的影響

溫度對細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成過程具有重要影響，而且細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的最適溫度不一定相同，因此，在發(fā)酵過程中需要選擇合適的培養(yǎng)溫度，分別在33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃條件下進行培養(yǎng)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)溫度對菌體生長和產(chǎn)酸的影響Fig.1 Effect of incubation temperature on cell growth and succinate production

由圖1可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于37℃時，琥珀酸的產(chǎn)量隨溫度升高而升高，當(dāng)培養(yǎng)溫度高于37℃，琥珀酸的產(chǎn)量隨溫度的升高而減小。當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時，菌體OD660nm最高，琥珀酸產(chǎn)量也達到最高8.42g/L，37℃是適宜的培養(yǎng)溫度。

2.1.2 培養(yǎng)基的初始pH對琥珀酸發(fā)酵的影響

城市交通智能化發(fā)展必須要遵循現(xiàn)有的城市化交通發(fā)展戰(zhàn)略，頂層的設(shè)計是城市交通朝向智能化發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，頂層的設(shè)計是解決城市智能化發(fā)展的首要目標(biāo)和重要任務(wù)[4]。因此，城市交通智能化發(fā)展在大數(shù)據(jù)時代下首先要充分利用互聯(lián)網(wǎng)等最新信息技術(shù)，以人工智能、綜合感知和普適計算作為支撐基點，實現(xiàn)城市發(fā)展和城市智能交通的雙面結(jié)合，對人群所需和其他活動于物流做出智能反應(yīng)，保障城市平衡發(fā)展。另外，還要尋求理論與技術(shù)創(chuàng)新使用于一體，主要著眼于建設(shè)決策者、系統(tǒng)服務(wù)對象等其他交通參與者的設(shè)定，并且對各類主體參與者的特征和參與者的空間分布進行有效性研究，達到城市空間與智能交通運營相互關(guān)聯(lián)。

微生物生長和生物合成都有其最適pH和能夠耐受的pH范圍。過高或過低的pH還會影響菌體的形態(tài)，同時對某些微生物的合成代謝途徑也有一定影響，從而影響發(fā)酵效果。因此，選擇合適的發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸至關(guān)重要。用pH值為5.8和7.9，濃度為0.2mol/L的磷酸緩沖液將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別設(shè)定6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4六個水平來進行發(fā)酵培養(yǎng)，考察不同培養(yǎng)基初始pH對琥珀酸發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 初始pH對菌體生長和產(chǎn)酸的影響Fig.2 Effect of initial pH on cell growth and succinate production

由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH值為6.8時，琥珀酸的產(chǎn)量最高，為8.75g/L，且菌體生長較好，pH過高或過低都會影響琥珀酸的產(chǎn)量。故選擇pH 6.8為培養(yǎng)基的初始pH。

2.2 琥珀酸發(fā)酵培養(yǎng)基主要因素優(yōu)化

2.2.1 水解糖質(zhì)量濃度對琥珀酸發(fā)酵的影響

玉米秸稈水解液中的纖維水解糖是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的主要碳源，因此，其在培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度非常重要，如果底物水解糖的質(zhì)量濃度過高，細(xì)胞生長會因細(xì)胞脫水而下降，并在某一質(zhì)量濃度下會阻遏1個或更多的影響產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。此外，水解糖的質(zhì)量濃度也會對琥珀酸的發(fā)酵周期產(chǎn)生一定影響。根據(jù)目前文獻報道，通常琥珀酸發(fā)酵的水解糖濃度一般在40g/L左右，因此，將水解糖質(zhì)量濃度為70g/L的水解液依次稀釋為20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L和70g/L六個水平，并以此為原料分別發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸來考察不同水解糖的質(zhì)量濃度對琥珀酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，對比結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同水解糖質(zhì)量濃度對菌體生長和產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effect of different hydrolyzate concentration on cell growth and succinate production

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基中水解糖質(zhì)量濃度高于60g/L時，琥珀酸產(chǎn)量減小，說明高于此質(zhì)量濃度的水解糖對琥珀酸的合成可產(chǎn)生抑制作用，OD660nm值的變化也是如此。而當(dāng)水解糖質(zhì)量濃度為60g/L時，琥珀酸產(chǎn)量達到15.84g/L，為水解糖的最佳質(zhì)量濃度。

2.2.2 玉米漿質(zhì)量濃度對琥珀酸發(fā)酵的影響

玉米漿是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌生長所依賴的主要氮源，且具備價格低廉和營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，同時也是工業(yè)上常用的有機氮源，在有關(guān)琥珀酸發(fā)酵的相關(guān)文獻報道中，玉米漿的應(yīng)用也較為廣泛。當(dāng)玉米漿作為氮源時，若質(zhì)量濃度過小，會造成菌體生長緩慢，從而影響產(chǎn)物的產(chǎn)率；若質(zhì)量濃度過大，會造成菌體生長旺盛，使養(yǎng)分過早耗盡，導(dǎo)致菌體提前衰老，從而縮短產(chǎn)物的生產(chǎn)期。因此需要選擇合適的玉米漿質(zhì)量濃度，分別設(shè)定玉米漿的初始添加質(zhì)量濃度為5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L和30g/L共六個水平發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸，來考察不同玉米漿添加量對琥珀酸產(chǎn)量的影響，對比結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同玉米漿質(zhì)量濃度對菌體生長和產(chǎn)酸的影響Fig.4 Effect of different corn syrup concentration on cell growth and succinate production

由圖4可知，當(dāng)玉米漿的添加量為10g/L，琥珀酸的產(chǎn)量為最高值8.33g/L。玉米漿的添加量高于或低于10g/L時，琥珀酸的產(chǎn)量會降低。故玉米漿的添加量為10g/L時最合適。

以生物發(fā)酵法制備琥珀酸，CO2、pH是影響菌體生長和琥珀酸產(chǎn)量的關(guān)鍵因素[7]。CO2在菌體的生長代謝過程中可作碳源被菌體利用，合成琥珀酸。環(huán)境pH的改變不僅會引起菌體內(nèi)外部化學(xué)環(huán)境和酶活力的變化，對細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響，而且還可以影響CO2的溶解水平，以及、的解離平衡，進而影響琥珀酸的合成。因此，在琥珀酸發(fā)酵過程中維持pH在適宜的范圍，對提高菌體的代謝活性和產(chǎn)琥珀酸能力具有重要作用。

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸過程中產(chǎn)生的有機酸可使pH值明顯下降。為了維持發(fā)酵液中的pH在一定范圍內(nèi)，可加入碳酸鹽作為酸堿中和劑。同時，碳酸鹽還可以提供一定的，并與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸反應(yīng)而釋放出CO2來維持琥珀酸發(fā)酵所需的CO2環(huán)境。另外，pH調(diào)節(jié)劑中的金屬陽離子在維持細(xì)胞新陳代謝方面起著重要作用。因此，選取添加量2.0mL Na2CO3、NH4HCO3、MgCO3、K2CO3、CaCO3這五種文獻報道較多且應(yīng)用較廣的碳酸鹽（濃度均為10mol/L）作為pH調(diào)節(jié)劑。通過在發(fā)酵12h、18h、24h、30h產(chǎn)琥珀酸放線桿菌代謝較旺盛的發(fā)酵時間點均添加以上5種碳酸鹽，來分別對比考察了這5種不同pH調(diào)節(jié)劑對琥珀酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果對比如圖5和圖6所示。

由圖5可知，5種碳酸鹽中Na2CO3的發(fā)酵產(chǎn)量最高，NH4HCO3和CaCO3的發(fā)酵產(chǎn)量相對較低，這可能是由于細(xì)胞膜對有較高的通透性，+的滲入會造成胞內(nèi)pH水平發(fā)生變化，細(xì)胞需要更多的能量將泵出，可見，環(huán)境中較高濃度會降低細(xì)胞對能量的利用效率。當(dāng)能量供給不足時，受胞內(nèi)的影響，胞內(nèi)的pH發(fā)生變化，影響細(xì)胞正常的生長代謝[8]，同時，由于CaCO3的溶解能力差，因此少量的CaCO3很難將pH維持在適合菌體生長的范圍。同時，已有研究表明，Ca2+對琥珀酸生產(chǎn)菌Mannheimiasucciniciproducens具有毒害作用[9]。同時，高濃度的Ca2+可以改變細(xì)胞膜正常的流動性和通透性，致使菌體不能進行正常的胞內(nèi)外物質(zhì)能量傳遞，從而影響產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的正常生長和代謝。此外，Mg2+在維持細(xì)胞新陳代謝方面起著重要作用，Mg2+是許多酶的激活劑，在琥珀酸合成途徑中的關(guān)鍵酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶）的輔助因子，對代謝流的分布起著關(guān)鍵的作用。因此，琥珀酸產(chǎn)量也整體相對較高。但是MgCO3成本較高，且會增加下游產(chǎn)品分離提取的難度，不利于生物法制備琥珀酸的產(chǎn)業(yè)化。

圖5 不同pH調(diào)節(jié)劑對琥珀酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different pH modifier concentration on succinate production

圖6 不同Na2CO3添加量對琥珀酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different Na2CO3addition on succinate production

由圖6可知，在發(fā)酵過程中當(dāng)培養(yǎng)基的Na2CO3（濃度為10mol/L）添加量為2mL時，琥珀酸產(chǎn)量最高，Na2CO3可以提供CO32-，且可以調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH，有利于產(chǎn)琥珀酸放線桿菌合成琥珀酸。當(dāng)Na2CO3添加量過高時，琥珀酸產(chǎn)量有所下降，可能是由于發(fā)酵過程中Na+濃度處于較高水平，造成高滲環(huán)境。這對菌體有較大的負(fù)面作用，使細(xì)胞不能正常代謝，最終導(dǎo)致琥珀酸產(chǎn)量的降低。

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化琥珀酸發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要因素

響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法[10]。利用響應(yīng)面法優(yōu)化琥珀酸放線桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基也是近幾年來研究的熱點。周彬等[12]通過響應(yīng)曲面法（RSM）優(yōu)化琥珀酸放線桿菌培養(yǎng)基組分，得到最優(yōu)發(fā)酵條件葡萄糖質(zhì)量濃度、酵母膏質(zhì)量濃度、溫度、培養(yǎng)基初始pH分別為39.1g/L、20.5g/L、37.3℃、7.6，最終，琥珀酸的發(fā)酵產(chǎn)量為37.2g/L。楊昆等[13]利用葡萄糖為原料，通過響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)琥珀酸發(fā)酵培養(yǎng)基，最終琥珀酸產(chǎn)量為33.45g/L。

為了提高琥珀酸產(chǎn)量，可采用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基。考慮到該試驗是優(yōu)化產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)合了前期試驗和文獻報道，確定碳源水解糖、氮源玉米漿和培養(yǎng)基中的酸堿中和劑Na2CO3為自變量考察因素，以琥珀酸質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，以反應(yīng)過程參數(shù)對琥珀酸產(chǎn)量的影響，以及各因素之間的交互作用，確定影響響應(yīng)值的顯著因素。經(jīng)過單因素初步優(yōu)化，確定了3個因素的添加量范圍。對3個顯著因子編碼，各因子設(shè)定水平及編碼見表1。

表1 試驗設(shè)計因素及編碼水平Table 1 Factors and coding levels of the experiment

為進一步考慮3種因素的交互作用及最佳添加量，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，進行3因素3水平試驗。以琥珀酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合。獲得響應(yīng)值—琥珀酸質(zhì)量濃度（Y）對影響琥珀酸質(zhì)量濃度的顯著因素—水解糖質(zhì)量濃度（X1）、玉米漿質(zhì)量濃度（X2）和Na2CO3添加量（X3）的二次多項式回歸模型為Y=19.61+0.62X1+ 0.034X2+0.46X3-0.33X1X2+1.11X1X3+1.51X2X3-1.85X1X1-2.84X2X2-3.45X3X3。

由表3的回歸模型方差分析可知，模型（P值＜0.000 1）是非常顯著的，模型失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率[11]。而失擬項P值0.317 4＞0.05，模型失擬項不顯著，說明殘差由隨機誤差引起，模型選擇合適。回歸系數(shù)R2=0.983 7＞0.9，擬合度＞90%，說明模型相關(guān)度很好，可以使用該模型來分析響應(yīng)值的變化，試驗誤差較小，可用此模型對琥珀酸濃度進行分析和預(yù)測。

由表4可知，回歸模型中的一次項X1（水解糖質(zhì)量濃度，g/L）的P值0.015 1＜0.05，表示影響非常顯著；而X2（玉米漿質(zhì)量濃度，g/L）的P值0.866 1＞0.05，表示影響不顯著；X3（Na2CO3添加量，mL）的P值為0.048 8，影響較顯著；交互項中X1X3的P值為0.0049，影響非常顯著，X2X3的P值為0.0009，影響也非常顯著，而另外一個交互項X1X2的P值為0.273 3，交互作用不顯著。該結(jié)果表明水解糖質(zhì)量濃度和pH調(diào)節(jié)劑Na2CO3的添加量對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵產(chǎn)量影響較明顯，且水解糖質(zhì)量濃度和pH調(diào)節(jié)劑Na2CO3的添加量對琥珀酸質(zhì)量濃度交互作用較明顯。根據(jù)系數(shù)估計值X1=0.62、X2=0.034和X3=0.46，可知影響因素的顯著性順序為：水解糖質(zhì)量濃度＞Na2CO3添加量＞玉米漿質(zhì)量濃度。

表2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and result of response surface methodology

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗Table 4 Significance test of regression model coefficient

2.2.5 模型交互項的分析

基于二次回歸模型進行響應(yīng)面及等高線如圖7所示。

圖7 各因素相互作用對琥珀酸產(chǎn)量的影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of interaction among corn syrup concentration,hydrolyzate concentration and Na2CO3addition on succinate production

由圖7可知，玉米漿質(zhì)量濃度不變，隨著水解糖質(zhì)量濃度的增加，琥珀酸產(chǎn)量也呈遞增趨勢，當(dāng)水解糖質(zhì)量濃度逐漸接近60g/L時，琥珀酸產(chǎn)量呈遞增趨勢，若水解糖質(zhì)量濃度持續(xù)升高，則琥珀酸產(chǎn)量會逐漸呈下降趨勢，可能原因是由于水解糖質(zhì)量濃度過高或玉米秸稈水解液中的有毒物質(zhì)過高從而抑制了產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的代謝所致。

由圖7可知，當(dāng)水解糖質(zhì)量濃度不變時，Na2CO3添加量逐漸接近2mL時，琥珀酸產(chǎn)量呈遞增趨勢；若Na2CO3添加量繼續(xù)增加，則琥珀酸產(chǎn)量會呈下降趨勢。這是由于高濃度的Na2CO3會造成微生物的滲透壓升高，從而抑制微生物代謝，影響琥珀酸的發(fā)酵產(chǎn)量。

由圖7可知，當(dāng)Na2CO3添加量不變時，若玉米漿質(zhì)量濃度逐漸接近10g/L時，琥珀酸產(chǎn)量呈遞增趨勢；若繼續(xù)增加玉米漿質(zhì)量濃度，琥珀酸的產(chǎn)量則會呈下降趨勢。

基于以上圖7的響應(yīng)面模型分析可知，響應(yīng)值存在最大值，經(jīng)軟件分析計算，得到琥珀酸產(chǎn)量預(yù)測值最大時的組分含量：水解糖質(zhì)量濃度為60g/L，玉米漿質(zhì)量濃度為10g/L，Na2CO3（濃度為10mol/L）添加量為2mL，預(yù)測值為19.6134g/L。經(jīng)過擬合試驗的驗證，琥珀酸產(chǎn)量實際值為18.32g/L。驗證值與響應(yīng)面模型優(yōu)化值基本一致。并獲得了較高的琥珀酸產(chǎn)量，提高了產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的發(fā)酵產(chǎn)量，說明優(yōu)化模型可靠性較好。

2.3 1L厭氧瓶分批發(fā)酵放大試驗

經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，采用最優(yōu)的發(fā)酵條件，以水解糖質(zhì)量濃度為59.66g/L（葡萄糖質(zhì)量濃度為28.84g/L、木糖質(zhì)量濃度為30.82g/L）的玉米秸稈水解液為原料在1L厭氧甁中進行分批發(fā)酵放大試驗，結(jié)果如圖8所示。

圖8 1L厭氧瓶中琥珀酸產(chǎn)量和副產(chǎn)物乙酸變化趨勢Fig.8 Variation tendency of succinate and byproducts acetic acid production in anaerobic bottle of 1 L

由圖8可知，在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵6h后琥珀酸產(chǎn)量開始大量產(chǎn)生，24h琥珀酸生成速率達到最大，42h琥珀酸的產(chǎn)量達到最高值19.66g/L，此時，琥珀酸生成速率為0.47g/（L·h）。此外，在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸過程中還會伴有少量的副產(chǎn)物乙酸的生成。

3 結(jié)論

利用玉米秸稈為原料，通過以水解糖質(zhì)量濃度為39.99g/L（葡萄糖質(zhì)量濃度為19.07g/L、木糖質(zhì)量濃度為20.82g/L）的玉米秸稈水解液為基礎(chǔ)，對溫度培養(yǎng)基和初始pH等因素并結(jié)合響應(yīng)面進行了厭氧甁條件下影響因素的優(yōu)化研究，得出產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（A.succinogenes）ATCC 55618發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的最佳培養(yǎng)條件：溫度37℃、初始pH 6.8、水解糖質(zhì)量濃度70g/L、玉米漿質(zhì)量濃度10g/L、Na2CO3（10mol/L）2mL。并在1L的厭氧甁中進行了分批發(fā)酵放大試驗，琥珀酸產(chǎn)量最高達19.66g/L?？梢詾檫M一步利用纖維水解液為原料來擴大規(guī)模發(fā)酵琥珀酸提供一定的參考。

本研究的主要優(yōu)勢在于采用可持續(xù)利用的秸稈原料，并采用廉價的工業(yè)氮源，這將會有效減少現(xiàn)今琥珀酸發(fā)酵對淀粉原料的依賴性，并且降低原料成本[6]。這不僅擺脫了對化石能源的依賴，同時又不會與人爭糧，而且開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，使琥珀酸成為未來最重要的生物基化工產(chǎn)品之一[14-16]。

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Optimization of succinic acid fermentation from corn stalk hydrolysate

XIE Hui1,ZHANG Zhaokun1,WU Qiong1,WANG Fengqin1,REN Tianbao2,SONG Andong1*
(1.College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

Using corn stalk hydrolysate as raw material,the fermentation conditions ofActinobacillus succinogenesATCC 55618 were optimized.The effect of culture temperature,initial pH,and medium composition on the production of succinic acid was studied,and the addition of hydrolysised sugar,corn syrup and Na2CO3was optimized by response surface methodology.Results showed that the optimal fermentation was determined as follows:temperature 37℃,initial pH 6.8,hydrolysised sugar mass concentration 60 g/L,corn syrup mass concentration 10 g/L,and 10 mol/L Na2CO32 ml.Scale-up experiments were performed in 1 L anaerobic bottle,and the yield of succinic acid could reach 19.66 g/L.

corn stalk;hydrolysate;succinic acid;optimization;response surface methodology

TQ424.19

A

0254-5071（2014）04-0110-06

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.027

2014-02-23

“十二五”863計劃生物和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域國家科技計劃課題（2012AA022301）

謝慧（1979-），女，講師，博士研究生，研究方向為生物基產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用。*

宋安東（1972-），男，教授，博士，研究方向為微生物能源工程。