四川冬菜中苯乳酸高產(chǎn)菌株的分離與鑒定

鄧林

（四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院酒類與食品工程系，四川都江堰611830）

四川冬菜中苯乳酸高產(chǎn)菌株的分離與鑒定

鄧林

（四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院酒類與食品工程系，四川都江堰611830）

通過雙層平板拮抗法和牛津杯瓊脂擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品四川冬菜中分離篩選得到18株乳酸菌。結(jié)合反相高效液相色譜法得到1株苯乳酸高產(chǎn)菌株DL-13，其發(fā)酵上清液中苯乳酸含量為143mg/L。結(jié)合菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生理生化特性，最終確定菌株DL-13為植物乳桿菌。

四川冬菜；苯乳酸；篩選；鑒定

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）即2-羥基-3-苯基丙酸[1-2]，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種天然抑菌化合物，在食品生產(chǎn)中可作為新型生物防腐劑使用，具有較好的抑菌譜、溶解性和穩(wěn)定性[3]。很多微生物如乳酸菌（Lactobacillus）[4]、白地霉（Geotrichum candidum）[2]、紅球菌（Rhodococcus）[5]和丙酸霉（Propionic acid mildew）[6]都能產(chǎn)生苯乳酸。乳酸菌是公認(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS）的微生物，近年來研究的熱點(diǎn)轉(zhuǎn)為通過乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸[7-9]。2000年，LAVERMICOCCA P等[1]首次報(bào)道從酸面團(tuán)中分離到的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）21B，苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到56.44mg/L。隨后研究相繼獲得多株產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌，但菌株間產(chǎn)量差異較大，且苯乳酸產(chǎn)量相對(duì)都較低[4，10]。要實(shí)現(xiàn)微生物工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸，必須要有高產(chǎn)苯乳酸的菌種來源，所以苯乳酸生產(chǎn)菌的篩選具有重要的研究?jī)r(jià)值和意義。

四川冬菜是一種半干態(tài)發(fā)酵性腌制品，細(xì)嫩味鮮，香氣濃郁，是四川人常食用的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品[11]。本研究選用四川冬菜作為乳酸菌資源，通過雙層平板拮抗法和牛津杯瓊脂擴(kuò)散法的初篩試驗(yàn)，再結(jié)合反相液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中苯乳酸含量，分離篩選出1株高產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌菌株，并對(duì)菌株進(jìn)行了初步鑒定，以期為進(jìn)一步的菌種馴化選育及工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸奠定理論基礎(chǔ)，為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供菌種來源，也能為四川冬菜中發(fā)酵微生物菌群的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)樣品

四川冬菜：四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 主要試劑

苯乳酸：美國(guó)Sigma公司。其他試劑均為分析純：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20.0g，吐溫-80 1.0mL，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，瓊脂18.0g，蒸餾水1 000mL，pH 6.2～6.6。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，氯化鈉10.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1 000mL，pH7.0。

初篩培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的碳酸鈣和0.1%山梨酸鉀。

發(fā)酵培養(yǎng)基：液體MRS培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

FA 2004型電子分析天平：上海精密儀器有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；奧林巴斯生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀、Agilent Zorbax SB-C18 USP L1分析柱（4.6mm×150mm，5μm）：美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 乳酸菌的分離

將10g于組織搗碎機(jī)中粉碎后的四川冬菜倒入三角瓶中，加200mL蒸餾水，充分振蕩。取1mL冬菜處理液分別接種于苯乳酸含量為1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL的初篩培養(yǎng)基中，37℃富集培養(yǎng)24h。采用常規(guī)平板梯度稀釋法進(jìn)行初篩，挑選有碳酸鈣溶解圈的單菌落進(jìn)行鏡檢[11-12]。將單菌落平板劃線進(jìn)行純化培養(yǎng)，反復(fù)3次。挑取單菌落轉(zhuǎn)接于斜面MRS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后放入冰箱，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 初篩方法

雙層平板拮抗法：指示菌為金黃色葡萄球菌。平板下層為固體MRS培養(yǎng)基，受試菌于下層培養(yǎng)基上劃線后，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h。然后傾注10mL半固體LB培養(yǎng)基于平板上層。將金黃色葡萄球菌配成濃度為106CFU/mL的菌懸液，均勻涂布于上層培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，觀察抑菌情況[13]。

牛津杯瓊脂擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)：取發(fā)酵液于100℃保溫20min后，5 000r/min離心15min。取上清液調(diào)節(jié)pH值至5，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑：以抑菌圈直徑（cm）為指標(biāo)，重復(fù)3次，取平均值作為結(jié)果。

1.3.4 復(fù)篩方法

將菌株以5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)36h。得到的發(fā)酵液經(jīng)過5 000r/min離心15min后取上清液，使用反相高效液相色譜法測(cè)定苯乳酸的含量，篩選出苯乳酸高產(chǎn)菌株。

反相高效液相色譜法條件為：流動(dòng)相A為0.5g/L三氟乙酸溶液，B為乙腈溶液，洗脫程序是：0～20min為10%～100%B，20～23min保持100%B，流速1mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL[14-15]。

1.3.5 苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取0.300 0g苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于0.1%磷酸緩沖液（pH2.5），定容至10mL。稀釋苯乳酸溶液質(zhì)量濃度分別為60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/L、180mg/L。用0.45μm膜過濾各質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液后用反相高效液相色譜法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

以峰面積A（y）對(duì)苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 苯乳酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of phenyllactic acid

2.2 四川冬菜中產(chǎn)苯乳酸菌株的分離篩選

2.2.1 出發(fā)菌株對(duì)苯乳酸耐受力

出發(fā)菌株于液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)對(duì)苯乳酸的耐受力結(jié)果見表1。

表1 出發(fā)菌株對(duì)苯乳酸的耐受力Table 1 Tolerance of original strain to phenyl-lactic acid

菌株對(duì)產(chǎn)物的耐受力與產(chǎn)物存在沒有必然的聯(lián)系，而與菌株個(gè)體特性相關(guān)。但在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的產(chǎn)物，較容易篩選出產(chǎn)量較高且對(duì)產(chǎn)物耐受力較強(qiáng)的菌株[16]。由表1可知，當(dāng)苯乳酸質(zhì)量濃度由1mg/mL逐漸增加至3mg/mL時(shí)，菌株生長(zhǎng)良好，當(dāng)苯乳酸質(zhì)量濃度為4mg/mL時(shí)，出發(fā)菌株長(zhǎng)勢(shì)較弱，且當(dāng)苯乳酸質(zhì)量濃度高于5mg/mL時(shí)菌株不能正常生長(zhǎng)。因此以4mg/mL作為苯乳酸高產(chǎn)菌株的初篩濃度。

2.2.2 初篩結(jié)果

用四川冬菜處理液進(jìn)行碳酸鈣溶解圈試驗(yàn)，篩選得到菌株128株。雙層平板拮抗法篩選結(jié)果見圖2，可知受試菌株對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。牛津杯瓊脂擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)結(jié)果見圖3，抑菌圈直徑為28mm，可見發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。選擇抑菌圈直徑≥25mm的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)，得到菌株18株。

圖2 雙層平板拮抗法篩選結(jié)果Fig.2 Screening result of antibacterial test by double plate antagonistic method

圖3 牛津杯瓊脂擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)篩選結(jié)果Fig.2 Screening result of antibacterial test by Oxford cup agar diffusion method

2.2.3 反相高效液相色譜測(cè)定結(jié)果

圖4 苯乳酸標(biāo)樣(A)及菌株DL-13發(fā)酵上清液(B)的HPLC圖譜Fig.4 Chromatograms of phenyllactic acid standard(A)and strain DL-13 fermentation supernatant(B)

反相高效液相色譜測(cè)定結(jié)果顯示，18株菌株的發(fā)酵上清液都出現(xiàn)了苯乳酸色譜峰，表示其都具有通過自身代謝發(fā)酵產(chǎn)苯乳酸的能力，其中有8株菌的發(fā)酵產(chǎn)物中苯乳酸含量在80mg/L以上，菌株DL-13發(fā)酵液中苯乳酸含量最高，達(dá)到143mg/L。苯乳酸標(biāo)樣和菌株DL-13發(fā)酵上清液反相高效液相圖譜見圖4。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將獲得的高產(chǎn)菌株DL-13接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，芽胞染色，鞭毛染色，并在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)[17]。

菌株DL-13在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)菌落突起，圓形，邊緣整齊，光滑，濕潤(rùn)，灰白色。在含3%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上形成明顯的透明圈。

菌株DL-13為革蘭氏陽性短桿狀細(xì)胞，單個(gè)、成對(duì)或形成短鏈，大小為（0.5～1.0）mm×0.5mm，無芽胞，不具運(yùn)動(dòng)性。

2.3.2 生理生化特性鑒定

對(duì)菌株DL-13進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)，乙?；状迹╒oges-Proskauer，VP）試驗(yàn)，甲基紅（methy red，MR）試驗(yàn)，糖發(fā)酵試驗(yàn)等，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》，進(jìn)行鑒定。生理生化特性結(jié)果見表2。

表2 菌株DL-13的生理生化特性Table 2 Biochemical and physiological characteristics of strain DL-13

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性結(jié)果，對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》，由表2結(jié)果，將DL-13菌株鑒定為植物乳桿菌，并命名為L(zhǎng)actobacillus plantarumDL-13。

3 結(jié)論

四川省傳統(tǒng)發(fā)酵食品冬菜是一種半干態(tài)發(fā)酵性腌制品，在發(fā)酵的過程中涉及到多種微生物的聯(lián)合協(xié)同作用。對(duì)四川冬菜中的發(fā)酵微生物菌群進(jìn)行了研究，在菌種初篩時(shí)添加一定質(zhì)量濃度的苯乳酸，通過雙層平板拮抗法結(jié)合牛津杯瓊脂擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)，分離篩選得到了一株高產(chǎn)苯乳酸的菌株DL-13。對(duì)其發(fā)酵上清液進(jìn)行反相液相色譜測(cè)定，其苯乳酸含量為143mg/L。

通過形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定分析，初步鑒定分離得到的高產(chǎn)苯乳酸的菌株DL-13為植物乳桿菌，命名為L(zhǎng)actobacillus plantarumDL-13。

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Isolation and identification of phenyl-lactic acid high-yield strains in Sichuan preserved vegetable

DENG Lin
(Department of Alcoholic Drink and Food Engineering,Sichuan Technology and Business College,Dujiangyan 611830,China)

By double plate antagonistic method and Oxford cup agar diffusion method of antibacterial test,18 strains of lactic acid bacteria from Sichuan preserved vegetable which could produce phenyl-lactic acid during fermentation were obtained.Results of reserved phase HPLC showed that mass concentration of phenyl-lactic acid in the culture medium supernatant of strain DL-13 was 143 mg/L.Combining with morphological,biochemistry and physiological test,strain DL-13 was identified asLactobacillus plantarum.

Sichuan preserved vegetable;phenyl-latic acid;isolation;identification

TS 255.54

A

0254-5071（2014）04-0097-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.024

2013-12-17

四川省教育廳課題（13ZB0364）

鄧林（1977-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。