葡聚糖酶產(chǎn)生菌的誘變選育

郭成栓

（廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510520）

葡聚糖酶產(chǎn)生菌的誘變選育

郭成栓

（廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510520）

利用紫外線(xiàn)誘變育種方法分離對(duì)前期分離到一株葡聚糖酶野生菌株P(guān)5進(jìn)行誘變。通過(guò)平板初篩、搖瓶復(fù)篩，從誘變菌株中篩選出一株高產(chǎn)菌株，其發(fā)酵酶活力可以達(dá)到5.85U/mL；在此基礎(chǔ)上，對(duì)誘變菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶工藝進(jìn)行了初步的優(yōu)化，其最適碳源為淀粉，最適氮源為花生餅粉，正交試驗(yàn)結(jié)果表明，淀粉含量為5%、花生餅粉含量為4%、NaH2PO4含量為0.2%時(shí)，該菌株的產(chǎn)酶量最高，酶活力達(dá)到21.23U/mL。

枯草芽孢桿菌；葡聚糖酶；酶活力；誘變；突變株

狹義的葡聚糖酶特指內(nèi)切β-1,3-1,4-葡聚糖酶，是一種重要的工業(yè)用酶，在生產(chǎn)生活中廣泛應(yīng)用于釀造、飼料、食品、紡織等諸多行業(yè)[1-6]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶的主要來(lái)源為微生物[7-12]，包括細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌等，其中芽孢桿菌是產(chǎn)生葡聚糖酶的一種主要菌種，在生產(chǎn)生活中具有較大的研究?jī)r(jià)值。

葡聚糖酶的酶活性低是影響生產(chǎn)應(yīng)用的一大瓶頸，因此往往要對(duì)野生菌株進(jìn)行選育。近來(lái)，雖然基因工程等育種方法在微生物育種工作中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用[13-14]，但是，傳統(tǒng)的誘變育種在大多數(shù)工業(yè)微生物育種中仍占有重要的地位[15-16]。從自然界篩選β-1,3-1,4葡聚糖酶高產(chǎn)菌株，對(duì)其進(jìn)行誘變育種并從中篩選產(chǎn)酶活力高的突變株仍是對(duì)其進(jìn)行應(yīng)用研究的常用方法和途徑。

微生物的代謝過(guò)程受到培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的影響，要利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)該酶，優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件，對(duì)于其生產(chǎn)應(yīng)用也非常關(guān)鍵，國(guó)內(nèi)外[8，10，12]也開(kāi)展了相關(guān)的研究工作。因此本研究以前期篩選獲得的具有較高葡聚糖酶活力的枯草芽孢桿菌P5為試驗(yàn)菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變育種，通過(guò)誘變篩選，以獲得葡聚糖酶產(chǎn)量提高的正向突變株，在此基礎(chǔ)上初步研究該突變菌株的產(chǎn)酶條件，以為葡聚糖酶的生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌P5：前期分離得到[17]。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%酵母膏，pH=7.0，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5%葡聚糖、0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%酵母膏，pH=7.0，121℃滅菌20min。

篩選培養(yǎng)基：0.5%葡聚糖、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.004mg/mL剛果紅、2%瓊脂，pH=7.0，121℃滅菌20min。

1.1.3 試劑

10mg/mL的葡萄糖溶液：稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖1.0g定容至100mL。

0.05 mol/L檸檬酸緩沖液，pH=4.8緩沖溶液的配制[1]。

1.0 %的葡聚糖底物：稱(chēng)取β-葡聚糖1.000 0g溶于100mL 0.05mol/L的酸性緩沖液中，磁力攪拌至完全溶解（室溫條件下3h以上）。標(biāo)記為1.0%β-葡聚糖酸性溶液，同時(shí)標(biāo)記pH=4.80、4℃保存。

DNS試劑：10g 3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS），置于600mL水中，逐漸加入20g NaOH，在50℃水浴中攪拌溶解，再依次加入200g酒石酸鉀鈉，5g苯酚和5g無(wú)水亞硫酸鈉，待全部溶解后，冷卻至室溫，用水定容至1 000mL。貯存于棕色瓶中暗處放置7d后使用。

1.2 儀器與設(shè)備

QYC200全溫度恒溫培養(yǎng)搖床：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2012 PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海達(dá)平儀器有限公司；SW-CJ型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備公司；eppendof 5810高速冷凍離心機(jī)：艾本德中國(guó)有限公司；DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海中安醫(yī)療器械廠；YXK.SJ41.280A高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 紫外誘變方法

菌懸液的制備：用無(wú)菌生理鹽水洗下?tīng)I(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上枯草芽孢桿菌，振蕩使菌體分散均勻，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整菌體數(shù)量約為106個(gè)/mL，備用。

紫外誘變處理：將菌懸液用無(wú)菌生理鹽水稀釋至106個(gè)/mL，移至無(wú)菌平皿中，置于磁力攪拌器上，在15W紫外燈下距離30cm處進(jìn)行誘變處理。將未經(jīng)誘變處理及誘變處理后的菌懸液各取0.1mL分別涂布于初篩培養(yǎng)基上，37℃暗室培養(yǎng)2d，計(jì)算致死率，以致死率70%～90%為最佳誘變時(shí)間。

1.3.2 篩選方法

平板初篩：待初篩培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落后，挑選菌落水解圈直徑和菌落直徑比值（HC值）相對(duì)較大的菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，以待進(jìn)一步復(fù)篩。

搖瓶復(fù)篩：將平板初篩獲得的菌株接種至液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)2d，測(cè)定發(fā)酵液的酶活力。

1.3.3 發(fā)酵工藝的初步優(yōu)化

碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響：以1%（w/v）蛋白胨分作為氮源，碳源分別采用1%（w/v）的葡聚糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉作為碳源，考察不同碳源對(duì)葡聚糖酶活力的影響。

氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響：以1%（w/v）的可溶性淀粉作碳源，分別采用1%（w/v）的酵母粉、蛋白胨、大豆餅粉、花生餅粉、硫酸銨作為氮源，考察不同氮源對(duì)葡聚糖酶活力的影響。

無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響：在只含碳源、氮源的培養(yǎng)基中，分別添加0.1%（w/v）的CaCl2、MgSO4、NH4Cl、NaH2PO4、KH2PO4、ZnSO4，考察不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)葡聚糖酶活力的影響。

碳源及氮源正交試驗(yàn)優(yōu)化：以淀粉、花生餅粉、NaH2PO4作為3因素，采用3水平正交試驗(yàn)：淀粉（3.0%、4.0%、5.0%）、大豆餅粉（3.0%、4.0%、5.0%），NaH2PO4（0.1%、0.2%、0.3%）培養(yǎng)基裝量為50mL，自然pH值，接種量體積分?jǐn)?shù)為5%，37℃、200r/min發(fā)酵48h，測(cè)定酶活力。

1.3.4 葡聚糖酶酶活力測(cè)定[17]和定義

酶活定義：在試驗(yàn)條件下，每分鐘分解β-葡聚糖產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶蛋白的量定義為1個(gè)酶活單位（U/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線(xiàn)誘變時(shí)間的選擇

將出發(fā)菌株分別置于紫外燈下照射30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s，然后將誘變菌株及出發(fā)菌株稀釋到合適的濃度，涂布于葡聚糖篩選平板上，分別計(jì)數(shù)出發(fā)菌株及誘變菌株的菌落數(shù)，計(jì)算不同照射時(shí)間的致死率結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，紫外線(xiàn)照射180s時(shí)，菌株的致死率達(dá)到80%，所以選擇180s作為出發(fā)菌株的誘變時(shí)間。

圖1 出發(fā)菌株的紫外誘變曲線(xiàn)Fig.1 UV mutation curve of original strain

2.2 葡聚糖酶高產(chǎn)菌株的初步篩選

表1 初篩出發(fā)菌株與突變菌株的比較Table 1 Comparison of preliminary screening original strain and mutant strain

將紫外線(xiàn)誘變后的枯草芽孢桿菌涂布在葡聚糖平板上面，37℃暗室培養(yǎng)2d，測(cè)量葡聚糖平板上菌落水解圈直徑以及菌落直徑，挑選菌落水解圈直徑與菌落直徑比值（HC值）較大的單菌落，葡聚糖平板上面挑選出5株比值較大的菌落（見(jiàn)表1）。從表1可以看出，從突變株Tb3的HC值最大，是出發(fā)菌株的1.62倍，初步判斷具有較高的產(chǎn)酶能力，這也說(shuō)明，從紫外線(xiàn)誘變的突變株中篩選出了少數(shù)發(fā)生了正向突變的突變株，至于在液體培養(yǎng)基中他們發(fā)酵產(chǎn)酶的能力如何，還有待進(jìn)一步搖瓶復(fù)篩進(jìn)行驗(yàn)證，所以將篩選出的5株HC值較大的菌落接種到斜面上保存，以供進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。

2.3 葡聚糖酶高產(chǎn)菌株的復(fù)篩

將初篩得到的5株水解圈直徑/菌落直徑比值較大的菌株接種到搖瓶中，置于搖床上37℃振蕩培養(yǎng)2d，發(fā)酵液離心，取上清液，測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在初篩出來(lái)的5株突變株中，Tb3菌株的葡聚糖酶活力最高，達(dá)到5.28U/mL，其他幾株突變株的酶活力大于初始菌株，這說(shuō)明初篩得到的幾株HC比值較大的菌株在液體培養(yǎng)基中也具有較高的產(chǎn)酶能力，與初篩結(jié)果基本吻合。在該試驗(yàn)中對(duì)于出發(fā)菌株只是使用了一種誘變劑進(jìn)行了一輪誘變，初始菌株的產(chǎn)酶能力得到了一定程度的提高，但是提高的幅度有限，所以在后續(xù)研究中，可以采用復(fù)合誘變劑進(jìn)行多輪誘變，該菌株產(chǎn)酶的能力會(huì)得到進(jìn)一步提高[18-19]。

表2 復(fù)篩出發(fā)菌株與突變菌株葡聚糖酶活力的比較Table 2 Glucanase activity comparison of secondary screening strain and mutant strain

2.4 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，碳源中，葡聚糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶的活性最高，其次是可溶性淀粉，兩者差別不大，考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，碳源采用可溶性淀粉，因?yàn)槠湓蠌V泛，成本低廉。當(dāng)碳源采用1%的可溶性淀粉時(shí)，酶活力可以達(dá)到7.52U/mL。

圖2 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of carbon source on glucanase production

2.5 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，氮源中，花生餅粉的產(chǎn)酶效果最好，其次為大豆餅粉、蛋白胨，而無(wú)機(jī)氮源硫酸銨則產(chǎn)酶量比較低?；ㄉ灧圩鳛檎ビ偷母碑a(chǎn)品，來(lái)源廣，價(jià)格低廉，當(dāng)?shù)床捎?%的花生餅粉時(shí)，酶活力可以達(dá)到10.28U/mL，這對(duì)其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)是非常有利的。

圖3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on glucanase production

2.6 無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

無(wú)機(jī)鹽一方面是微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)又可以起到調(diào)控滲透壓的的作用，對(duì)微生物的生命活動(dòng)及酶活性的調(diào)控具有重要的作用。從圖4可以看出，培養(yǎng)基中添加的各種無(wú)機(jī)鹽對(duì)酶活力的影響，其中添加NaH2PO4后，葡聚糖酶活力最高，達(dá)到12.50U/mL。這可能是因?yàn)镹aH2PO4中的磷可能是葡聚糖合成過(guò)程中所需酶或輔酶的組成元素，因此對(duì)葡聚糖酶的合成具有重要的影響，同時(shí)NaH2PO4中的鈉離子可能對(duì)葡聚糖酶的生產(chǎn)也具有一定的促進(jìn)作用。

圖4 無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of different inorganic salts on production of glucanase

2.7 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)中，篩選出了最優(yōu)碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽，所以分別以最優(yōu)碳源（淀粉）、氮源（花生餅粉）、無(wú)機(jī)鹽（NaH2PO4）作為影響因素，進(jìn)一步探討各因素不同水平對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)葡聚糖酶的影響，進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，從R值大小可以看出，葡聚糖酶產(chǎn)酶量影響因素大小為可溶性淀粉>花生餅粉>NaH2PO4，可溶性淀粉對(duì)葡聚糖酶生產(chǎn)的影響最大，在3因素中極差最明顯。從K值大小可以得到發(fā)酵最適水平組合為A3B2C2，即可溶性淀粉5.0%、花生餅粉4.0%及NaH2PO40.2%，但是這一方案未包含在正交試驗(yàn)方案中，因此將試驗(yàn)菌株接種在該組合培養(yǎng)基中進(jìn)行酶活力驗(yàn)證試驗(yàn)，酶活力測(cè)定結(jié)果表明該培養(yǎng)基條件發(fā)酵產(chǎn)酶的活力可以達(dá)到21.23U/mL。

表3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for mediumformula optimization

在該項(xiàng)研究中對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行了一個(gè)初步的優(yōu)化，只是對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的單一碳源及氮源進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)際上，在發(fā)酵過(guò)程中，不同的碳氮源之間有時(shí)具有互補(bǔ)效應(yīng)，因此采用復(fù)合碳氮源有時(shí)反而會(huì)提高產(chǎn)酶的能力[20]，所以后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步對(duì)該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的復(fù)合碳源及氮源進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)進(jìn)行更多因素更多水平的優(yōu)化，從而得到更優(yōu)的培養(yǎng)基配方，進(jìn)而提高該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的能力，為利用該菌株發(fā)酵進(jìn)行酶的生產(chǎn)及應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

3.1 利用紫外線(xiàn)誘變育種方法，對(duì)從土壤中篩選出的一株葡聚糖酶高產(chǎn)菌株進(jìn)行了誘變育種，利用葡聚糖平板初篩，從突變菌株中篩選出了5株HC值較大的菌株，然后將5株突變菌株接入搖瓶進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果從5株突變菌株中篩選出一株葡聚糖酶高產(chǎn)菌株Tb3，其搖瓶發(fā)酵酶活力達(dá)到5.28U/mL，其他4株突變株的酶活力也得到了一定程度的提高。

3.2 對(duì)枯草芽孢桿菌菌株Tb3液體發(fā)酵條件產(chǎn)酶的條件進(jìn)行了初步的研究，初步研究結(jié)果表明，該菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為花生餅粉。在此基礎(chǔ)上對(duì)最適碳源、最適氮源以及無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行了3因素3水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果表明，可溶性淀粉對(duì)葡聚糖酶生產(chǎn)的影響最大。當(dāng)最適碳源可溶性淀粉含量為5.0%，最適氮源花生餅粉含量為4.0%，無(wú)機(jī)鹽NaH2PO4含量為0.2%時(shí)，其發(fā)酵酶活力最高，達(dá)到21.23U/mL。

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Mutation breeding of high glucanase producing strain

GUO Chengshuan
（College of Biotechnology,Guangdong Food and Drug Vocational Institute,Guangzhou 510520,China）

UV mutation breeding method was used to mutate a glucanase-producing wild strain P5 isolated in earlier stage.A high glucanase-producing strain was screened by plate screening and shaking flask culture with glucanase activity of 5.85 U/ml.Furthermore,the fermentation medium of mutant strain was optimized,and the optimum carbon source and nitrogen source was starch and peanut meal,respectively.The optimum medium formula was determined as follows:soluble starch 5%,peanut meal 4%,NaH2PO40.2%.Under these conditions,the fermentation glucanase activity reached up to 21.23 U/ml.

Bacillus subtilis;glucanase;enzyme activity;mutation;mutant strain

TS201.3

A

0254-5071（2014）04-0090-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.022

2014-02-28

2013年建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研項(xiàng)目（20131277）；廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（2009YZ005）

郭成栓（1977-），男，講師，博士，主要從事發(fā)酵工程、酶工程的研究工作。