響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取山荊子抗氧化物質(zhì)工藝

呂娜，劉陽(yáng)，夏海洋，崔艷艷，沈明浩，張捷

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波315100）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取山荊子抗氧化物質(zhì)工藝

呂娜1，2，劉陽(yáng)1，夏海洋1，崔艷艷1，沈明浩1，張捷2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波315100）

采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法研究超聲波提取山荊子抗氧化物質(zhì)的工藝條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、提取時(shí)間對(duì)提取液抗氧化性的影響。建立該工藝的二次多項(xiàng)式模型。依據(jù)回歸分析確定最優(yōu)提取條件。結(jié)果表明：回歸模型具有高度顯著性。最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)57%，提取時(shí)間42min，超聲功率為493W。此時(shí)提取液抗氧化性最強(qiáng)，亞鐵還原能力（FRAP）值達(dá)最大值12 375.8。

山荊子；FRAP法；抗氧化能力；響應(yīng)面法；提取條件

山荊子（Malus baccata）又名山定子、山丁子、堂梨子、水楸子，為一種耐寒性極強(qiáng)的薔薇科蘋果亞科蘋果屬落葉喬木的果實(shí)[1-5]。山荊子資源主要分布在我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、山西、河北、陜西、甘肅[6-7]。成熟的山荊子果具有獨(dú)特的風(fēng)味及豐富的營(yíng)養(yǎng)素，食用價(jià)值很高，還具有促進(jìn)人體物質(zhì)代謝，增強(qiáng)人體消化吸收能力等重要的生理功能[8]。在食品工業(yè)中，山荊子果可制作飲料，也可釀制果酒等[9-10]。一些研究表明，生長(zhǎng)于寒冷氣候下的水果比溫帶氣候水果具有更豐富的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)主要為一些具有抗氧化活性的酚類化合物[11]。超聲波提取技術(shù)由于具有提取時(shí)間短、有效成分提取率高、成本低、低溫保護(hù)熱敏性成分等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于植物化學(xué)物的提取[12]。響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。與正交試驗(yàn)相比，該法試驗(yàn)周期短，求得的回歸方程精度高，可研究幾個(gè)因素間的交互作用。本研究采用超聲波法通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和超聲功率對(duì)山荊子抗氧化活性物質(zhì)提取的影響，確定了最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山荊子來(lái)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)果園；三吡啶三吖嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：美國(guó)Sigma公司；FeSO4、FeCl3等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-2型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；DELTA320型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；SP-722E可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山荊子提取物的制備

山荊子成熟后烘干、粉碎。分別稱取1g粉末，設(shè)定料液比1∶10，根據(jù)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定每組的提取條件，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中提取，得到的提取液離心后取上清，真空濃縮后用用溶劑定容至10mL，待測(cè)。

1.3.2 提取液抗氧化性的測(cè)定

參照BENZIE I F F等[13]的方法，采用亞鐵還原/抗氧化能力（Ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測(cè)定山荊子提取液的抗氧化性的大小。將濃度為25～800μmol/L的FeSO4溶液250μL與3mL預(yù)熱至37℃的FRAP工作液（由0.3mol/L醋酸鹽緩沖液25mL、10mmol/L TPTZ溶液2.5mL、20mmol/L FeCl3溶液2.5mL組成）混合，反應(yīng)10min后，于波長(zhǎng)593nm處測(cè)定其吸光度值，以O(shè)D593nm值（y）為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程為：y=0.002 3x+0.195 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。同樣取3μL提取液與247μL蒸餾水混勻，再與3mL FRAP工作液反應(yīng)，同樣測(cè)定OD593nm值。根據(jù)反應(yīng)后吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)FeSO4的濃度（μmol/L），定義為FRAP值。FRAP值越大，表明溶液中含有的抗氧化活性物質(zhì)越多，即抗氧化活性越強(qiáng)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以FRAP值為考察指標(biāo)，比較FRAP值與乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和超聲功率的關(guān)系。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)方案

在3個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)因素水平，以FRAP值為響應(yīng)值（Y），通過(guò)Box-Behnken Design模型設(shè)計(jì)3因素3水平的試驗(yàn)，并結(jié)合響應(yīng)面分析法對(duì)山荊子抗氧化活性物質(zhì)提取的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)FRAP值的影響

控制反應(yīng)條件為超聲功率400W，提取時(shí)間30min，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0、20%、40%、60%、80%時(shí)，檢測(cè)提取液的FRAP值，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＜60%時(shí)，F(xiàn)RAP值隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞60%時(shí)，F(xiàn)RAP值反而下降。這可能因?yàn)楫?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，山荊子果實(shí)中脂溶性物質(zhì)的溶出量增大，使抗氧化活性物質(zhì)的溶解度降低，從而導(dǎo)致FRAP值降低。因此，選取體積分?jǐn)?shù)60%乙醇作為提取溶劑較適合提取山荊子中的抗氧化活性物質(zhì)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取液FRAP值的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on FRAP value of extract

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)FRAP值的影響

控制反應(yīng)條件為超聲功率400W，提取劑為體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，分別超聲10min、20min、30min、40min、50min、60min后，檢測(cè)提取液FRAP值的大小，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)提取時(shí)間＜40min時(shí)，所獲提取液的FRAP值隨提取時(shí)間的增加而增加。40min時(shí)FRAP值達(dá)到最大，之后隨提取時(shí)間增加FRAP值減小，這可能與山荊子較長(zhǎng)時(shí)間的暴露于超聲波環(huán)境中，導(dǎo)致了果實(shí)中部分具有抗氧化活性的物質(zhì)結(jié)果被破壞有關(guān)。

2.1.3 超聲功率對(duì)FRAP值的影響

設(shè)定提取劑為體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，提取時(shí)間40min，分別用100W、200W、300W、400W、500W、600W、700W的超聲波提取山荊子中的抗氧化活性物質(zhì)，提取液的FRAP值如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)超聲功率為500W時(shí)，F(xiàn)RAP值達(dá)到最大，即提取液的抗氧化活性達(dá)到最高值。而繼續(xù)增加超聲功率，F(xiàn)RAP值反而減小，可能是由于超聲波功率過(guò)高導(dǎo)致了山荊子中抗氧化活性物質(zhì)的破壞。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化山荊子抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiment

采用Design-Expert 8.05b軟件，對(duì)表2中的結(jié)果進(jìn)行多元擬合回歸，獲得FRAP值對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸模型：

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性，對(duì)回歸模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知，模型的P＜0.000 1，差異極顯著，說(shuō)明該模型擬合度較好，回歸方程能很好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，證明了該方法是可靠的。失擬項(xiàng)P=0.398 9＞0.05，差異不顯著，表明可以用該模型預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.975 1，說(shuō)明該模型能解釋97.51%的響應(yīng)面變化。變異系數(shù)（coefficientofvariation，CV）為5.48%，說(shuō)明模型的置信度較高，模型方程能夠較好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。以上表明可以用該模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)山荊子抗氧化物質(zhì)提取的最佳條件。從回歸方程各項(xiàng)方差分析結(jié)果看出，因素A、BC、A2、B2對(duì)響應(yīng)值有極顯著影響，AB、AC、C2對(duì)響應(yīng)值有顯著影響。結(jié)果表明，試驗(yàn)各因素對(duì)抗氧化活性物質(zhì)提取的影響不呈簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，3因素對(duì)響應(yīng)值影響的大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞超聲功率。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

各因素之間兩兩相互關(guān)系對(duì)FRAP值影響的響應(yīng)面及等高線見圖4。由圖4可知，F(xiàn)RAP值隨乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率及提取時(shí)間增大呈先增后降的趨勢(shì)，說(shuō)明3個(gè)因素在所選范圍內(nèi)能產(chǎn)生最佳的響應(yīng)值。在響應(yīng)面分析中，曲面越陡峭表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大[14-15]?？梢姡掖俭w積分?jǐn)?shù)對(duì)提取液FRAP值的影響最顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面中曲面較陡，提取時(shí)間次之，而超聲功率對(duì)FRAP值的影響最不顯著，表現(xiàn)為曲線較平滑。

2.2.4 提取工藝條件的確定

通過(guò)二次回歸預(yù)測(cè)的最佳工藝參數(shù)為體積分?jǐn)?shù)57%乙醇溶液、超聲功率493W、提取時(shí)間42min，在此條件下提取液的FRAP理論值為12 324.2。采用該工藝進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到提取液的FRAP平均值為12 375.8，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，與響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果差異不顯著，置信區(qū)間（confidence interval，CI）＜95%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝科學(xué)合理，準(zhǔn)確可靠。

圖4 各兩因素交互作用對(duì)提取液FRAP值影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plot and contour line of the interaction among each two factors of ethanol concentration volume fraction,ultrasonic power and extraction time on FRAP value of the extract

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)山荊子抗氧化成分進(jìn)行了提取工藝優(yōu)化，得到了最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)57%，超聲功率493W、提取時(shí)間42min。在此條件下，F(xiàn)RAP值為12 375.8。研究結(jié)果為今后野生山荊子資源的綜合利用以及天然抗氧化劑的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

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Optimization of ultrasonic wave extraction of antioxidant substances from Malus baccataby response surface methodology

Box-Behnken response surface methodology was employed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of antioxidant substances from Malus baccata.On the basis of single factor investigation,effects of ethanol volume fraction,ultrasonic power and extraction time on the antioxidant activity of the extract were investigated.A quadratic regression model equation which described the extraction process was fitted.The optimum extraction parameters were determined by the regression analysis and the fitted regression model had high statistical significance.The optimum extraction conditions were determined as follows:ethanol volume fraction 57%,ultrasonic time 42 min,ultrasonic power 493 W.Under these conditions, the extract showed highest antioxidant activity with the FRAP value of 12 375.8.

Malus baccata;FRAP assay;antioxidant capacity;response surface methodology;extraction condition

O629.9

A

0254-5071（2014）04-0052-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.013

2014-02-25

浙江省科技廳公益項(xiàng)目（2010C32066）；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金（201308）

呂娜（1980-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。