固態(tài)發(fā)酵植物藥提取殘?jiān)a(chǎn)飼料蛋白工藝條件*

楊 威，左金龍，車春波，李俊生，梁金鐘，王麗萍

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

固態(tài)發(fā)酵植物藥提取殘?jiān)a(chǎn)飼料蛋白工藝條件*

楊 威，左金龍，車春波，李俊生，梁金鐘，王麗萍

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

以某制藥廠雙黃連制劑生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄藥渣作為研究對(duì)象，在對(duì)藥渣成份進(jìn)行了全分析的基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)法研究了混菌固態(tài)發(fā)酵植物藥提取殘?jiān)a(chǎn)飼料蛋白工藝參數(shù)的不同，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量的影響。結(jié)果表明：以40g藥渣，35g玉米漿，8g玉米面，15g麩皮，2g尿素組成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，產(chǎn)朊假絲酵母與扣囊擬內(nèi)孢霉的菌種配比為2∶1時(shí)，最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，接種量15%，含水量65%，培養(yǎng)時(shí)間60h。在最佳發(fā)酵條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量可達(dá)29.98%。以廢棄藥渣為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料是切實(shí)可行的。

固態(tài)發(fā)酵；植物藥提取殘?jiān)?；正交?shí)驗(yàn)；飼料蛋白

植物藥提取過程中產(chǎn)生的大量廢棄物殘?jiān)黐1]，如果處理不當(dāng)將會(huì)造成環(huán)境污染。目前，我國(guó)的中藥制藥生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于植物藥提取過程中產(chǎn)生的大量廢棄物殘?jiān)奶幹梅绞街饕蟹贌?、堆肥、重提取和菌體培養(yǎng)[2]。隨著我國(guó)對(duì)環(huán)境治理力度的加大，對(duì)于植物藥提取殘?jiān)M(jìn)行綜合利用的研究成為中藥制藥行業(yè)面臨的重要課題。大部分中藥渣含有氨基酸、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、粗蛋白等有機(jī)物，以及磷、鐵、鉀等無機(jī)元素[3]，因此，可以作為微生物的培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白。一方面可以提高植物藥提取殘?jiān)睦寐?，?jié)約藥用植物資源、另一方面又可以彌補(bǔ)我國(guó)飼料蛋白的短缺，同時(shí)又可減少植物藥提取殘?jiān)鼘?duì)環(huán)境的污染，對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文以哈爾濱中藥二廠提供的雙黃連制劑生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄藥渣為培養(yǎng)基，選用產(chǎn)朊假絲酵母和扣囊擬內(nèi)孢霉進(jìn)行混菌固態(tài)發(fā)酵，重點(diǎn)研究了混菌固態(tài)發(fā)酵植物藥提取殘?jiān)a(chǎn)飼料蛋白工藝參數(shù)諸如發(fā)酵溫度、接種量、含水量、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

HZS-H水浴震蕩器；電子分析天平；植物粉碎機(jī)；潔凈工作臺(tái)；DSX-280AI型不銹鋼手提式滅菌器；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱；101-1-S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母（黑龍江微生物研究所）；扣囊擬內(nèi)孢霉（哈爾濱商業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室）。

1.3 實(shí)驗(yàn)原料及試劑

植物藥提取殘?jiān)ü幖瘓F(tuán)中藥二廠，主要為黃芩的殘?jiān)?，烘干后?0目標(biāo)準(zhǔn)篩過篩后備用；玉米漿（哈藥集團(tuán)制藥總廠）；玉米面、麩皮（市售）。

其他試劑：H2SO4、HCl、乙醇、丙酮、CuSO4、K2SO4、硼酸、NaOH、甲基紅指示劑、混合指示劑、葡萄糖、酵母膏、K2HPO4、MgSO4、（NH4）2SO4、尿素、瓊脂。除了瓊脂和酵母膏外均為分析純?cè)噭?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥渣的預(yù)處理方法藥渣烘干后于40目標(biāo)準(zhǔn)篩過篩后，稱取5g藥渣，加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的稀硫酸，按固液比1∶7攪拌均勻，常壓煮沸回流3h，抽濾，水洗至濾液呈中性，測(cè)定水抽提液還原糖含量[4]。

1.4.2 分析方法

1.4.2.1 粗蛋白質(zhì)含量分析依照GB/T6432-1994[5]（凱氏定氮法）進(jìn)行。稱取2g藥渣或取發(fā)酵產(chǎn)物1g（干重），測(cè)定產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量。

1.4.2.2 纖維素的測(cè)定采用硝酸乙醇法[6]。

1.4.2.3 半纖維的測(cè)定采用酸水解法[6]。

1.4.2.4 木質(zhì)素的測(cè)定采用酸水解法[6]。

1.4.2.5 還原糖的測(cè)定采用費(fèi)林試劑法[7]

1.4.2.6 灰分的測(cè)定采用灰化法[8]。

1.4.2.7 水分的測(cè)定采用常壓烘干法[8]。

1.4.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖8g、酵母膏2g、玉米漿5g、K2HPO40.1g、MgSO40.05g、（NH4）2SO40.5g、尿素0.5g、瓊脂2g加100mL水溶解。

液態(tài)培養(yǎng)基：葡萄糖8g、酵母膏2g、玉米漿5g、K2HPO40.1g、MgSO40.05g、（NH4）2SO40.5g、尿素0.5g加100mL水溶解。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用正交試驗(yàn)法，用4因素3水平（見表1），選取L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)

結(jié)果進(jìn)行極差分析。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基配比因素水平Tab.1 Factors and levels of fermentation medium

1.4.4 固態(tài)發(fā)酵將所選用的兩株菌活化，分別接種到250mL裝有液態(tài)種子培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃，培養(yǎng)24h震蕩（110r·min-1），混合后以某百分?jǐn)?shù)（以總量計(jì)）的接種量接種于按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中（見表4），30℃靜置發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)48h。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥渣的預(yù)處理結(jié)果

表2反映了利用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的稀硫酸處理藥渣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（以產(chǎn)物還原糖含量作為考察指標(biāo)）。處理后半纖維水解為單糖進(jìn)入到水解液中，纖維素的平均聚合度下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：H2SO4的濃度越高，處理后的水解液中還原糖的含量越大。藥渣用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的硫酸處理后水解液中的還原糖含量達(dá)到50.23%，處理效率較高。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇4%的H2SO4對(duì)藥渣進(jìn)行預(yù)處理。

表2 稀H2SO4處理結(jié)果Tab.2 Results of sulphuric acid pretreatment

2.2 原料藥渣成分分析結(jié)果

表3反映了原料藥渣中纖維素、半纖維、木質(zhì)素、粗蛋白質(zhì)、水分及灰分的含量。黃芩藥渣主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。纖維素是由β-1，4糖苷鍵結(jié)合而成的高分子多糖，其糖鏈通過氫鍵堆積起來形成緊密的結(jié)晶構(gòu)造，聚合度很高，它不溶于水，沒有還原性，與碘也不起呈色反應(yīng)，在常溫下不發(fā)生水解作用。由于木質(zhì)素、半纖維素對(duì)纖維素的保護(hù)作用以及纖維素本身的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，天然的木質(zhì)纖維素直接進(jìn)行水解時(shí)，其水解程度是很低的。因此，要利用纖維素類物質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)能源（如酒精）或高蛋白食品（如單細(xì)胞蛋白），必須對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理。

表3 藥渣成分分析結(jié)果Tab.3 Results of component analysis on extractive residue of Chinese herbs

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

利用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)以探討發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)物粗蛋白的影響（產(chǎn)朊假絲酵母與扣囊擬內(nèi)孢霉母的比例為2∶1，固體培養(yǎng)基成分為：藥渣40g，玉米漿35g，玉米面8g，麩皮15g，尿素2g），發(fā)酵完畢后將發(fā)酵產(chǎn)物在60℃下烘干進(jìn)行粗蛋白含量測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Orthogonal design on L9（34）and the results of experiment

由表4可知，影響發(fā)酵蛋白飼料粗蛋白的主次因素次序?yàn)楹浚窘臃N量＞溫度＞時(shí)間。最佳工藝組合為D3B3A2C3。即溫度30℃、含水量65%、接種量15%、發(fā)酵時(shí)間60h。按照正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵條件，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵后的粗蛋白含量為29.48%。

2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證較優(yōu)試驗(yàn)條件的再現(xiàn)性，進(jìn)行了如下試驗(yàn)：產(chǎn)朊假絲酵母與扣囊擬內(nèi)孢霉的比例為2∶1，固體培養(yǎng)基成分為：藥渣40g，玉米漿35g，玉米面8g，麩皮15g，尿素2g，按照正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵條件，即溫度30℃、含水量65%、接種量15%、發(fā)酵時(shí)間60h，進(jìn)行發(fā)酵重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵后的粗蛋白含量參見表5。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Validation of the experiment

3 結(jié)論

（1）原料藥渣主要由33.62%纖維素、43.46%的半纖維素，11.51%的木質(zhì)素構(gòu)成，粗蛋白含量為8.99%。以該種藥渣為原料進(jìn)行混合酵母菌固態(tài)發(fā)酵，可以有效地提高藥渣中的粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而提高廢棄藥渣附加值，實(shí)現(xiàn)廢棄中藥渣的資源化利用。

（2）為提高菌種對(duì)藥渣的利用率，需要對(duì)藥渣進(jìn)行預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的稀H2SO4處理效率較高。

（3）正交實(shí)驗(yàn)表明，以40g藥渣，35g玉米漿，8g玉米面，15g麩皮，2g尿素組成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，產(chǎn)朊假絲酵母與扣囊擬內(nèi)孢霉的菌種配比為2∶1時(shí)，最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，接種量15%，含水量65%，培養(yǎng)時(shí)間60h。在上述最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，所得的發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量由原來的8.99%提高到29.98%。

［1］楊磊，夏祿華，張衷華，等.植物提取生產(chǎn)中固形廢棄物生態(tài)化利用的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)［J］.現(xiàn)代化工，2008，28（4）：14-16.

［2］鄒艷敏，吳靜波，仰榴青，等.中藥渣的綜合利用研究進(jìn)展［J］. 2008，40（12）：113-115.

［3］馬遜風(fēng)，馬宏軍，唐占輝，等.中藥渣剩余成分分析及利用途徑研究［J］.東北師大學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2004，36（2）：108-110.

［4］楊威.黃芩藥渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，22（5）：14-16.

［5］GB/T6432-1994.

［6］彭志英.食品生物技術(shù)導(dǎo)論［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2008.

［7］李建武，等，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與方法［M］.北京:北京大學(xué)出版社，2004.

［8］中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］：北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.123-124；附錄52-63.

Research on technique of producing feeding protein from extractive residue of chinese herbs by fermentation*

YANG Wei，ZUO Jin-long，CHE Chun-bo，LI Jun-sheng，LIANG Jin-zhong，WANG Li-ping
（School of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China）

Solid-state fermentation of extractive residue of Chinese herbs which comes from a traditional Chinese medicine plant to produce feeding-protein by the mixed fermentation was studied and the technique parameters in solid-state fermentation process was optimized with the aid of orthogonal experiments based on analyzing the component of the extractive residue of Chinese herbs.The results indicated that the optimum technique parameters in the fermentation process are as below:cultivate temperature is 30℃,inoculated quantity is 15%（W/W），moisture content is 65%and cultivate time is 60h when the proportion of Yeast stain is 2∶1（Candida utilis：Endomycopsis fibuligera）and 40g residue，35g corn steep liquor，8g corn flour,15g wheat bran and 2g urea were chosen to make up of fermentation medium.Under the optimum fermentation condition,the content of crude protein in fermentation product could be reach 29.98%.Producing feeding protein from extractive residue of Chinese herbs by fermentation is feasible.

solid-state fermentation;extractive residue of Chinese herbs;orthogonal experiment;feedingprotein

X705

A

1002-1124（2014）08-0020-03

2014-06-24

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究資助項(xiàng)目（11531071）

楊威（1964-），女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究領(lǐng)域：固體廢棄物資源化及水處理技術(shù)。