沼澤紅假單胞菌砷代謝基因多樣性及進化分析

郭少偉，呂常江，2，張意，趙春貴

（1.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門361021；2.浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州310027）

微生物在與砷的長期相互作用過程中進化出各種各樣的砷代謝機制，在自身解毒過程中伴隨著砷價態(tài)及形態(tài)的轉(zhuǎn)化，對砷的地球化學(xué)循環(huán)起到了重要的影響［1］.近年來，微生物砷代謝研究發(fā)展迅速，先后報道了7種砷代謝機制［2］，包括細胞質(zhì)As（Ⅴ）還原、呼吸性As（Ⅴ）還原、化能自養(yǎng)As（Ⅲ）氧化、化能異養(yǎng)型的As（Ⅲ）氧化、As（Ⅲ）甲基化、不產(chǎn)氧光合作用偶聯(lián)的As（Ⅲ）氧化，以及As（Ⅴ）代替磷供細菌生長代謝，但研究證據(jù)并不支持最后一種砷代謝機制［3］.2004年，F(xiàn).W.Larimer等［4］首次測定了沼澤紅假單胞菌（R.palustris）［5］的CGA009菌株基因組序列；2006年，Qin等［6］從該菌株中克隆了轉(zhuǎn)甲基酶基因（ars M），首次提供了細菌砷甲基化機制的實驗證據(jù).前期研究結(jié)果表明：R.palustris對砷具有較強的抗性，能夠在厭氧條件下將胞內(nèi)的As（Ⅴ）還原為As（Ⅲ）［7］.對已公布全基因組APB的砷代謝基因簇結(jié)構(gòu)進行分析，R.palustris砷代謝基因簇具有更為復(fù)雜的“多操縱子”結(jié)構(gòu)［8］.但關(guān)于不同砷抗性（ars）操縱子中砷代謝基因之間如何表達和調(diào)控，尚缺乏系統(tǒng)而深入的研究.本文以基因組砷代謝基因簇相關(guān)基因序列為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)手段，系統(tǒng)分析R.palustris砷代謝基因簇及砷代謝相關(guān)基因arsR，ars M和ArsC蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 基因組序列的獲取和一般特征

分別從LPSN（http：∥www.bacterio.cict.fr／），IJSEM（http：∥ijs.sgmjournals.org／），ATCC（http：∥www.atcc.org／）和DSMZ（http：∥old.dsmz.de／index.htm）等網(wǎng)站獲取目前已報道的R.palustris菌株.然后，在 NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）及 MicrobesOnline（http：∥microbesonline.org／）數(shù)據(jù)庫以種名為關(guān)鍵詞獲取全基因組序列，描述R.palustris基因組的一般特征.

1.2 砷代謝相關(guān)基因及定位

在獲取的全基因組序列中搜索目標基因，以報道的砷代謝相關(guān)基因為參照［1-2，9-11］，通過 GenBank注釋獲取相關(guān)基因的定位及功能，利用BLAST工具獲取同源序列及基因注釋；然后，結(jié)合獲取基因序列的特征分析，確認基因功能注釋的準確性.同時，利用EMBL（http：∥www.embl.org／）與 DDBJ（http：∥www.ddbj.nig.ac.jp／）數(shù)據(jù)庫，對獲取的基因信息進一步確定.

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用Clustal X 2.0軟件對目的基因的核酸序列或蛋白的氨基酸序列比對分析，在Mega 5.0軟件上用鄰接法（neighbor joining，NJ）進行聚類分析.基于細菌全基因組序列的聚類分析參照文獻［12］的方法進行，利用 Mauve 2.3.1軟件獲取基因組進化距離矩陣（genome content distance matrix），并在Mega 5.0軟件上采用鄰接法進行分析.

2 結(jié)果和分析

2.1 R.palustris基因組的多樣性

從數(shù)據(jù)庫中共收集到7株R.palustris的全基因組序列，其基因組一般特征如表1所示.從表1可知：7個菌株均含有1條染色體，GC摩爾分數(shù)為64%～66%，僅CGA009含有1個質(zhì)粒；BisB5染色體相對較小，約為4.89 Mb，TIE-1染色體相對較大，約為5.74 Mb，其他5菌株染色體大小相近，約為5.5 Mb；DX-1含有105個假基因，遠遠高于其他菌株.此外，7個菌株含有的r RNA操縱元，r RNA及t RNA等數(shù)量上也存在一定的差異.CGA009砷代謝基因簇大小約為8.1 kb，明顯高于其他菌株.結(jié)果表明：R.palustris基因組特征上呈現(xiàn)出多樣性，R.palustris不同菌株具有高度異質(zhì)化和多樣化.

表1 R.palustris基因組一般特征Tab.1 General features of the genome of R.palustris

2.2 物種的進化關(guān)系和砷代謝基因簇結(jié)構(gòu)分析

R.palustris菌株砷代謝相關(guān)基因的分布與結(jié)構(gòu)，如圖1所示.從圖1可知：7個菌株的染色體中均含有以ars操縱子為主體的砷代謝基因簇，主要包括砷代謝調(diào)節(jié)基因（arsR）、細胞質(zhì)As（Ⅴ）還原酶基因（arsC）、As（Ⅲ）外排蛋白基因（arsB或acr3p）、轉(zhuǎn)甲基酶基因（ars M）、砷抗性相關(guān)功能基因（ars H）和未知功能基因（ars U）等.7個菌株中，ars操縱子主要包括arsRCC（acr3p）和arsRM兩種類型.研究結(jié)果表明：R.palustris具有細胞質(zhì)As（Ⅴ）還原代謝機制及As（Ⅲ）甲基化代謝機制.不同菌株的砷代謝基因簇由1至4個砷代謝操縱子組成，不同菌株基因簇中的基因組成、排列順序和方向有所不同.

圖1 R.palustris菌株砷代謝相關(guān)基因的分布與結(jié)構(gòu)Fig.1 Distribution and structure of the arsenic metabolic genes in R.palustris

16S r RNA基因序列和基因組進化距離矩陣聚類分析及砷代謝基因簇結(jié)構(gòu)的進化關(guān)系，如圖1所示.基于16S r RNA基因序列的分析表明：Bis A53，BisB18和 DX-1聚為一類；TIE-1，CGA009，BisB5和Ha A2聚為一類.基因組進化距離矩陣聚類分析顯示：BisB18和Bis A53聚為一類；Bis A53砷代謝基因簇在arsRCC（acr3p）基礎(chǔ)上進化出了arsRUU，構(gòu)成2個砷代謝操縱子；CGA009，TIE-1，DX-1，BisB5和Ha A2聚為一類.這5個菌株的特點是砷代謝基因簇更加復(fù)雜，而且均含arsRM.R.palustris不同菌株間存在著砷代謝基因的易位與倒位，不同菌株ars操縱子進化程度不同，進化趨向于結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的“多操縱子”.兩種聚類方式的結(jié)果雖然有差異，但基因組進化距離矩陣聚類分析分辨率更高，更容易分辨不同的菌株，同時與R.palustris菌株之間的砷代謝基因簇的進化關(guān)系［8］更相符.

圖2 基于arsR基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic relationships based on arsR gene

2.3 砷代謝調(diào)節(jié)基因的分析

調(diào)節(jié)基因?qū)虻谋磉_具有重要的調(diào)控作用.R.palustris菌株砷代謝基因簇中擁有多個操縱子，為了解不同操縱子中基因的表達關(guān)系，選擇R.palustris，以及另外2種APB不同菌株的不同類型操縱子和4株非光合細菌arsRBC操縱子上游的arsR序列進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖2所示.

從圖2可知：不同操縱子中arsC，acr3p及ars M上游的arsR系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系因種而異.以arsR（acr3p）C為例，在R.sphaeroides不同菌株中arsR同源性較高，而與R.vannielii的arsR的同源性較低.對arsRCC（acr3p）而言，在6株R.palustris中，Bis A53，CGA009，TIE-1，BisB5與BisB18的arsR同源性較高，而與DX-1相比，arsR同源性則較低.

arsRM操縱子上游的arsR也呈現(xiàn)出多樣性.研究結(jié)果表明：同種不同菌株間相同（或相似）類型操縱子上游的arsR可以有較大差異，不同類型操縱子上游arsR的同源性也可很高.arsR的同源性差異可能與環(huán)境中砷調(diào)控基因的表達有關(guān)，但含有多個ars操縱子的細菌在砷代謝過程中，不同操縱子中砷代謝基因如何表達調(diào)控，其與菌種（株）抗砷能力之間的關(guān)系等問題目前尚不明確，還需要更多的證據(jù).

2.4 細胞質(zhì)砷還原蛋白分析

細胞質(zhì)As（Ⅴ）還原酶基因（arsC）是ars操縱子的關(guān)鍵基因 .文獻報道的典型菌種（株）和R.palustrisArsC序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，如圖3所示.由圖3可知：5類不同的arsC表達產(chǎn)物中，現(xiàn)有的綜述文獻僅報道4類［13-14］.第Ⅰ類為ArsC以谷胱甘肽作為電子供體，第Ⅱ類為ArsC電子供體為硫氧還蛋白，第Ⅲ類命名為Arr2p，其電子供體與第一類相同，第Ⅳ類ArsC電子供體為mycothiol（MSH）.尤其是第Ⅴ類ArsC（syn ArsC），最先發(fā)現(xiàn)于集胞藻屬（Synechocystissp.PCC6803）中，隨后在其他淡水藻類中也發(fā)現(xiàn)了它的同源基因，其氨基酸序列與第Ⅱ類同源性較高，但電子供體卻與第一類相同［15-16］.分析發(fā)現(xiàn)，該類ArsC首先與第Ⅳ類聚為一類，再和第Ⅱ類聚在一起.

已有文獻認為，syn ArsC的變化機制是由ArsC催化位點上的半胱氨酸殘基位置所決定的［17］，但其進化來源尚不清楚.通過數(shù)據(jù)庫中n ArsC基因序列的同源性系統(tǒng)分析，尚未在其他細菌中發(fā)現(xiàn)該基因是否應(yīng)單獨列為一類，還值得探討.同時發(fā)現(xiàn)：7株R.palustris均含有第Ⅰ類ArsC，而BisB5，CGA009，BisB18，Bis A53，TIE-1和DX-1還含有第Ⅱ類ArsC，這種同一基因組中含有兩類arsC基因的現(xiàn)象明顯區(qū)別于其他光合生物，在非光合生物中也不常見，顯示出R.palustris砷代謝基因的多樣性.

2.5 轉(zhuǎn)甲基酶基因分析

圖4 基于ars M基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic relationships based on ars M gene

已有研究表明：轉(zhuǎn)甲基酶（Ars M）可將細胞內(nèi)的As（Ⅲ）轉(zhuǎn)化為甲基砷化物，最終生成揮發(fā)性三甲基砷（TMA）排出胞外，降低了環(huán)境中砷的濃度，能夠達到環(huán)境砷治理的目的［6］.因此，分析了R.palus-tris中ars M基因的多樣性.與R.palustrisBisB5的ars M序列相比，5株R.palustris及8株典型非光合生物的ars M序列的同源性達80%以上，其系統(tǒng)發(fā)育分析如圖4所示.從圖4可知：CGA009，TIE-1，BisB5和 DX-1的ars M聚為一類，而Ha A2的ars M聚為另一類，表明ars M具有多樣性.

3 討論

基于已公布的全基因組序列砷代謝基因簇的分析，解析了R.palustris砷代謝機制和砷代謝基因簇.R.palustris砷代謝機制的主體為ars操縱子介導(dǎo)的細胞質(zhì)As（Ⅴ）還原和As（Ⅲ）甲基化，菌株不同，砷代謝基因和砷代謝途徑有明顯差異.砷代謝基因簇的結(jié)構(gòu)與分布呈現(xiàn)多樣性，且不同菌株砷代謝基因簇進化程度不同，進化趨向于更為復(fù)雜的“多操縱子”結(jié)構(gòu).

調(diào)節(jié)基因在基因表達過程中發(fā)揮重要的作用，R.palustris砷代謝調(diào)節(jié)基因（arsR）具有多樣性，同種不同菌株間相同（或相似）類型ars操縱子上游的arsR有較大差異，不同類型操縱子上游的arsR的同源性也可以很高.arsR的多樣性可能與菌種（株）的環(huán)境適應(yīng)性有重要的關(guān)系，尤其是含有多操縱子砷代謝基因簇中砷代謝基因的表達和調(diào)控，尚缺乏系統(tǒng)而深入的實驗研究.

在同一基因組中含有兩類arsC基因的現(xiàn)象并不常見.已有研究表明：一株放線菌谷氨酸棒狀桿菌（ATCC 13032）中含有Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類ArsC［14］.本文的分析表明：7株R.palustris中均含有Ⅰ類ArsC，其中6個菌株同時含有Ⅰ和Ⅱ類ArsC.由此認為，這兩類arsC能夠同時表達，第Ⅱ類ArsC是第Ⅰ類ArsC功能上的補充，兩類arsC同時表達更有利于細胞內(nèi)物質(zhì)的有效利用，并增強了細菌對砷的抗性.但究竟是否如此，兩類ArsC在胞內(nèi)如何協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，尚缺乏實驗證據(jù).

As（Ⅲ）甲基化現(xiàn)象普遍存在于細菌、真菌、原生動物及高等動物中［18］.通過基因組砷代謝基因分析表明：R.palustris也普遍存在ars M，7株R.palustris中就有5株含有ars M，但不同菌株間，ars M同源性也具有較大差異.值得關(guān)注的是，有研究發(fā)現(xiàn)一些起始無甲基化現(xiàn)象的細菌，如Corynebacteriumsp，E.coli，F(xiàn)lavobacteriumsp，Proteussp和Pseudomonassp，在高濃度砷長期（6個月）誘導(dǎo)下，可將無機砷轉(zhuǎn)化為甲基砷化物［18］.因此，細菌中arsM是來源于自身基因的演化，還是存在其他未發(fā)現(xiàn)的甲基化途徑，也是值得探索的問題.

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