人毛囊外毛根鞘無色素性黑素細(xì)胞與白癜風(fēng)

袁 睿 綜述，陳德宇 審校

白癜風(fēng)是一種常見的原發(fā)性皮膚黏膜色素脫失癥，我國(guó)報(bào)道的社區(qū)人群發(fā)病率為0.09%～3.10%［1］,通常臨床上易診難治。現(xiàn)有研究證實(shí)，人毛囊外毛根鞘有一類無黑色素且未活化的黑素細(xì)胞（melanocytes，MC）［2-3］。它是由起源于神經(jīng)嵴的MC 在人胚胎2～5周向表皮、毛囊遷移中滯留于外毛根鞘轉(zhuǎn)化來的。其不僅可為毛囊提供黑素母細(xì)胞，還可作為白癜風(fēng)皮損區(qū)消失的MC 的主要來源。所以治療白癜風(fēng)的研究熱點(diǎn)之一即為研究AMMC?，F(xiàn)將其相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 AMMC的生物學(xué)特征

CUI等［2］于20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)AMMC主要位于毛囊外毛根鞘的中上部，數(shù)量少，常聚集分布，一般情況下處于休眠狀態(tài)，無黑素合成能力，屬于未分化的黑素細(xì)胞。體外光鏡下可觀察到AMMC胞體一般小于黑素細(xì)胞，折光度好，呈多角形。多為雙極，少數(shù)可為三級(jí)結(jié)構(gòu)。原子力顯微鏡下可觀察到AMMC胞體為長(zhǎng)梭形，有2～3個(gè)極突，極突與胞體分界不清，每個(gè)極突無二級(jí)分支或側(cè)枝，胞體與極突的側(cè)緣有許多微絨毛樣突起，向四周無規(guī)律伸展，形態(tài)各異。與表皮黑素細(xì)胞樹突內(nèi)充滿單個(gè)或∕和聚集的黑素小體所不同的是，AMMC極突內(nèi)未見清晰的顆粒狀隆起，僅在核周見許多直徑約300～500nm的黑素小體，多為Ⅱ、Ⅲ期，幾乎無成熟的Ⅳ期黑素小體［4］。透射電鏡下可觀察到：AMMC 為圓形、或橢圓形，包膜上的突起短且稀疏。胞體中央可見一卵圓形核，占胞體的30%～50%，多有一個(gè)核仁。胞質(zhì)內(nèi)最明顯的特點(diǎn)是含豐富的黑素小體，以Ⅱ、Ⅲ期為主，大小較為一致，均有單位膜包繞。線粒體多寡不一，僅于成熟黑素小體較多的細(xì)胞內(nèi)可常見到。以上特征均體現(xiàn)了AMMC的不成熟性，因此AMMC 一般也不表達(dá)與黑素相關(guān)的酶分子，缺乏特異性分子標(biāo)記［5］。所以可借助于NK1/beteb單抗和識(shí)別TYR,TRP1等聯(lián)合識(shí)別AMMC。其原因在于NK1/beteb 可識(shí)別未成熟黑素小體上的gp-100。運(yùn)用免疫組化的方法，用以上的單抗或多抗標(biāo)記之后可以觀察到：NK1/beteb 染色陽性細(xì)胞主要分布于生長(zhǎng)期毛囊外毛根鞘中段，一般情況下均低于皮脂腺水平，數(shù)目較少，常群集分布。由于AMMC只表達(dá)前黑素小體相關(guān)抗原，這也證明了外毛根鞘功能的不成熟性［6］。

2 AMMC的培養(yǎng)

白癜風(fēng)皮損區(qū)MC 缺失。再生的MC 來源于AMMC。如何刺激未成熟的且處于休眠狀態(tài)的AMMC 增值、分化、移行，已成為當(dāng)今關(guān)注的熱點(diǎn)。但一直以來該細(xì)胞的分離與培養(yǎng)都被視為一難題，這也使得后續(xù)的研究無法繼續(xù)。AMMC最早由Tobin［7］在1995 年以膠原酶法培養(yǎng)成功，但其方法很難去除成纖維細(xì)胞的污染且所使用的培養(yǎng)基促進(jìn)了AMMC的成熟。近期Tobin 等再次改良了培養(yǎng)基成分，但培養(yǎng)出的AMMC 仍然可產(chǎn)生黑素。目前，王大光等［8］對(duì)AMMC 的分離培養(yǎng)純化進(jìn)行了最新的改良，并取得了成功，其方法如下：（1）與頭皮提供者溝通獲得同意后，記錄基本信息后取頭皮。（2）頭皮經(jīng)碘伏消毒5 min，用PBS 液沖洗數(shù)次。（3）以眼科剪剪去脂肪組織及真皮上1 mm。再將頭皮剪成0.5 cm×1 cm 的皮片。（4）采用1%分離酶Ⅱ4℃消化24h，再37 ℃消化1h 后，眼科鑷輕輕擠壓使毛囊自動(dòng)游離。用含5%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基沖洗3 次。（5）收集游離毛囊并切除毛乳頭，離心后純化毛囊。（6）0.5%胰蛋白酶37℃消化10～15 min 至外毛根鞘細(xì)胞大部分游離，血清終止消化，吹打形成細(xì)胞懸液后200 目銅網(wǎng)過濾，1500 r∕min離心5 min。（7）基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MCDB153、谷氨酰胺、2%胎牛血清、干細(xì)胞因子、內(nèi)皮素、bFGF、雙抗。將獲取的細(xì)胞懸液以1×107個(gè)∕ml接種并培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的孵箱中。2d 后通過更換培養(yǎng)基來去除未貼壁細(xì)胞。7～8d 后按3：1 的比例第1 次傳代。以后每5～7d 按1：2 比例傳代。傳至3 代即可獲得純化的AMMC。

3 AMMC與白癜風(fēng)的治療

白癜風(fēng)的復(fù)色主要依賴于AMMC在各種因素的激活下分化并遷移到色素脫失處。現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)及臨床中常見的各種激活物作如下總結(jié)：（1）甲氧沙林（8-MOP）可以直接促進(jìn)鼠黑素母細(xì)胞，鼠黑素瘤細(xì)胞合成黑素［9-10］。CUI 等［2］也曾采用甲氧沙林加長(zhǎng)波紫外線（PUVA）治療復(fù)色皮膚，治療后人毛囊外毛根鞘出現(xiàn)了大量的多巴反應(yīng)陽性的MC。目前最新研究以首次傳代的AMMC 作為研究對(duì)象，經(jīng)TYR、TRP-1和TRP-2 多克隆抗體研究間接免疫熒光標(biāo)記，以含10、50、100umol/L 的甲氧沙林培養(yǎng)基培養(yǎng)可顯示：經(jīng)甲氧沙林作用3d 后AMMC 樹突增多、延長(zhǎng)、胞體變大，TYR表達(dá)量呈濃度依賴性增加，延長(zhǎng)作用時(shí)間后TRP-1、TRP-2 表達(dá)也呈上升趨勢(shì)［11］。這均可表明甲氧沙林參與AMMC的活化過程。（2）1,25二羥維生素D3（VID）臨床上可運(yùn)用于治療白癜風(fēng)，目前的研究表明其作用機(jī)制為：①使AMMC 細(xì)胞體積增大樹突增長(zhǎng)，形成具有多級(jí)樹突和強(qiáng)折光性的細(xì)胞。②可促進(jìn)AMMC 的絡(luò)氨酸酶活性和黑素生成，并呈濃度依賴關(guān)系。③作用后可使AMMC 內(nèi)黑素小體由Ⅰ、Ⅱ期向Ⅲ、Ⅳ大量轉(zhuǎn)化，線粒體增多、擴(kuò)張。④促進(jìn)TYR、TRP-1表達(dá)增強(qiáng)。（3）糖皮質(zhì)激素作為臨床上最常用于治療白癜風(fēng)的藥物，目前認(rèn)為其作用機(jī)制主要作為免疫抑制劑直接作用于皮損以抑制白癜風(fēng)皮膚中黑素細(xì)胞所受到的自身免疫的攻擊［12］及促進(jìn)黑素的合成，但并無明確的研究以證明以上觀點(diǎn)?，F(xiàn)已有學(xué)者使用倍他米松（BT）與AMMC共同孵育，其方法為：將傳至2 代的AMMC 以105/cm2 接種于6 孔培養(yǎng)板中，24h 后加入濃度為103,106,109mol/L 的BT，作用72h后分析TYR、TRP-1、TRP-2的表達(dá)。通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)他們課題組認(rèn)為BT 可促進(jìn)TYR、TRP-1 蛋白的表達(dá)并促進(jìn)黑素小體的成熟，而TYR及TRP-1是MC成熟后合成黑素的關(guān)鍵酶。因此，可以推斷糖皮質(zhì)激素促進(jìn)黑素生成主要是通過激活A(yù)MMC并促進(jìn)其增值而產(chǎn)生黑素從而治療白癜風(fēng)的［13］。

綜上可知，AMMC 作為未活化的黑素細(xì)胞受到各種刺激因素作用后激活、分化、成熟。之后可以移行到白癜風(fēng)的白斑區(qū)產(chǎn)生黑素，進(jìn)而治愈白癜風(fēng)。這為我們進(jìn)一步研究如何治療白癜風(fēng)提供了新的方向。

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